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[交流]
大家做亲和层析柱的时候，有没有遇到过载量突然下降或者非特异吸附特别凶的情况？
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虫友们好，最近在实验室纯化蛋白，又被亲和层析柱给折腾得不轻，心里一堆问号，实在憋不住想上来跟大家唠唠，看看有没有同病相怜或者有高见的朋友。 我用的就是最常见的那种镍柱，纯化带His标签的蛋白，方法也是老套路了。但最近这根柱子明显感觉“体力不支”，上样量没变，但流穿里的目标蛋白越来越多，感觉载量唰唰往下掉，心都在滴血啊。这还不是最头疼的，更烦的是杂蛋白粘得那叫一个结实，洗脱的时候跟着目标蛋白一起下来，纯度简直没眼看。我就在那儿琢磨，这亲和层析柱的脾气到底该怎么摸透？ 我自个儿瞎分析了一下，感觉可能性太多了，脑子有点乱。比如柱子寿命，是不是反复再生太多次，填料里的配基（像镍离子）脱落了？或者上样样品没处理好，虽然离心过滤了，但会不会有些细胞碎片或者油脂样的东西偷偷把填料孔给堵了、包住了？还有样品缓冲液的条件，pH、离子强度甚至还原剂啥的，是不是悄悄改变了蛋白和配基的“亲和力”？有时候甚至怀疑，蛋白自己会不会形成二聚体或者多聚体，把标签给藏起来了，导致柱子抓不住？ 另外，非特异吸附这个老大难，大家一般怎么破？我试过在缓冲液里加点低浓度的咪唑或者NaCl，有时候管用，有时候又感觉效果不明显。是不是不同蛋白的性子差别太大，都得一点点摸条件？还有，柱子保存和维护，大家有没有什么特别顺手的小技巧？比如怕长菌，但杀菌剂会不会伤柱子？ 总之，感觉亲和层析柱这东西吧，用起来原理好像挺直接，但真想让它稳定高效地工作，里头细节太多了，稍不注意就给你点颜色看看。特别想知道大家在实际操作中，有没有总结出什么实用的经验或者踩过哪些坑？比如有没有什么迹象能提前判断柱子状态不行了？或者遇到我这种问题，你们的排查顺序一般是啥样的？ 纯粹是技术讨论，求大佬们分享点心得，救救孩子吧，一起交流学习才能少走弯路啊！ |
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