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[交流] 干细胞实验常见疑难全解析：核心坑点梳理与高效解决方案指南

一、什么是干细胞？

干细胞是一类具有“干性”的原始细胞，具有不断复制的自我更新能力，以及分化为体内多种功能细胞的潜能。根据分化能力的不同，干细胞大致可分为：

1.全能干细胞：具有发育为完整个体的潜能，如受精卵；

2.多能干细胞：能够分化为几乎所有的人体细胞，如胚胎干细胞（embryoinc stem cells, escs）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, ipscs）；

3.专能干细胞：能够分化为特定谱系类型的细胞。

在人类研究体系中，人多能干细胞（hpscs）因来源广、伦理争议小且可实现个性化制备，已成为科研与应用中的理想模型。本文将以人多能干细胞为例子，带大家梳理干细胞研究中如何将基因编辑与文库筛选相结合，并解析其中的关键要点。

二、crispr/cas9系统在人多能干细胞上的应用

crispr/cas9系统是目前最为常用于有效的基因编辑体系，不仅适用于个体与细胞的基因敲除、点突变或敲入等编辑操作，还能应用于大规模的文库筛选，寻找未知功能靶点。

人多能干细胞与crispr/cas9系统相结合，可广泛应用于：

1.多能性维持和早期胚胎发育的调控机制研究

2.疾病机制探索和药物开发

3.功能细胞的工程化改造

4.细胞个性化治疗

5.基于干细胞体系的crispr筛选

三、干细胞的基因编辑难点

尽管人多能干细胞（hpscs）已在 crispr/cas9 体系中广泛应用，但由于其生物学特性和培养体系的特殊要求，相较于常用细胞系，hpscs 的常规基因编辑仍面临较高的技术门槛，主要体现在以下几个方面：

1.细胞品系和培养条件需严格调控；

人多能干细胞相对比较脆弱，细胞状态和多能性容易受到培养基成分、基质条件、操作环境等因素的影响，因此对培养体系的稳定性要求极高。

2.常用的转染方法在人多能干细胞上的转染效率极低；

目前广泛应用的化学转染方法如lipo3000、pei法等均无法真正有效地实现在人多能干细胞中的有效转染。

3.人多能干细胞在单克隆培养上存在存活低以及多能性无法维持等问题；

a.目前常用的单克隆挑取方法多需脱离超净台操作，存在一定污染风险；

b.人多能干细胞在进行单克隆形成时存在死亡率高、且极易存现多能性退出、自发分化以及遗传不稳定等问题。

四、干细胞crispr筛选的技术难点与破解思路

在干细胞研究中，如需开展大规模、无偏向的基因功能解析，crispr 文库筛选是必不可少的工具。整体流程与常规文库筛选相似，包括 sgrna 设计与合成、文库构建与病毒包装、文库cell pool构建、功能性筛选以及数据分析等环节。

然而，由于干细胞独特的生物学属性及对培养体系的高度依赖，在构建干细胞文库筛选平台时仍面临若干关键技术挑战，仍需要特别关注。

1.感染细胞的选择；

不同种类的干细胞，对应着不同的研究体系和目的。而人多能干细胞（esc/ipsc），具有长期增殖和维持能力，病毒感染相对于分化后的细胞更加容易，文库cell pool构建成功率高，是目前使用最多的类型，效果稳定，最为推荐；

2.细胞干性的维持；

干细胞文库构建的另一个关键要点，就是细胞干性的维持。人多能干细胞的文库cell pool的培养和编辑规模都非常大，要保证其文库cell pool的成功构建，除了在操作上的精细程度进一步提高之外，还需要使用到利用可诱导表达（tet-on）系统调控cas9 表达时序性的人多能干细胞系。可诱导表达系统的使用，不仅可以保证干细胞的文库cell pool构建过程中避免受到多能性相关基因被干预而造成的多能性推出问题，还能在不同阶段个性化控制文库筛选的启动，满足客户不同研究体系的需求，提高干细胞文库筛选的灵活度。

3.适用的分化方法；

a.在crispr筛选中，干细胞的分化体系是一个非常有效的功能筛选方式，但并非所有的分化方法都是适用于crispr筛选的。在分化方法上，推荐仅需要通过换液和整体传代的方式的分化方法，而一些可能因为人为或主观性操作造成局部细胞转移的，如挑克隆、不均匀的传代方式，均不适用于文库筛选，分析会造成比较大的误差。

五、干细胞定向分化

无论是基因编辑后的下游研究，还是文库 cell pool 的功能筛选，定向分化都是干细胞研究流程中不可缺少的关键步骤。然而，不同分化路线在方法与难度上差异显著，而体外定向分化普遍还面临以下共性挑战：

1.效率与纯度相对较低；

2.功能成熟度不足；

3.信号通路调控复杂度高；

4.规模化与成本相对较高。

针对干细胞定向分化的技术难点，源井生物已开发出多样化的干细胞定向分化平台。在现有的干细胞培养体系和 ipsc 相关技术基础上，进一步扩展了神经干细胞/前体细胞分化、前脑神经元分化以及心肌分化等方面的技术服务，同时也涵盖了早期三胚层分化、定向内胚层分化、以及心肌分化试剂盒等三款定向分化相关产品，为干细胞基因编辑后的下游定向分化研究提供了完整的技术支撑。

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1楼2025-12-04 17:20:01

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