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天然生长因子“储藏室”：磺化丝素蛋白实现FGF-2的高效结合与活性递送
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研究背景 细胞外基质（ECM）通过其生化与结构特性调控细胞行为，并在生长因子的储存与递送中发挥关键作用。成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）作为一种重要的肝素结合生长因子，在体内与ECM中的硫酸化糖胺聚糖（如硫酸乙酰肝素）结合，影响其稳定性、活性和信号传导。然而，天然ECM材料存在免疫原性、批次差异等限制。因此，开发能够模拟ECM功能的人工材料，实现生长因子的可控释放与活性保持，成为组织工程中的重要研究方向。 丝素蛋白（SF）因其良好的生物相容性、可降解性和可修饰性，被广泛用于组织工程。然而，天然SF缺乏特异性细胞黏附和生长因子结合位点。通过化学修饰引入功能性基团，如磺酸基团，可赋予SF类似ECM的生长因子结合与调控能力。 研究内容 本研究通过重氮偶联反应，将4-氨基苯磺酸的重氮盐与SF的酪氨酸残基偶联，成功制备了磺化SF衍生物。天然SF在275nm处有酪氨酸特征吸收峰，而磺化衍生物在325nm处出现偶氮基团的特征吸收峰，表明偶联反应成功。随着重氮盐添加量的增加，325nm处的吸光度逐渐升高，表明磺酸基团修饰程度增加（图1A）。通过紫外-可见光谱法分析偶氮苯基团的掺入量，以确定每个SF分子的磺酸基团数量。根据紫外吸光度计算，制备的衍生物每个SF分子分别含约20、40、55和70个磺酸基团，对应的酪氨酸修饰百分比分别为8%、15%、20% 和 25%（图1B）。 图1 磺化丝素蛋白衍生物的合成与表征 通过测量天然SF薄膜和磺化SF衍生物薄膜在水蒸气处理后的接触角来确定磺化程度对亲水性的变化（图2）。天然SF薄膜的接触角约为71°，而磺化衍生物薄膜的接触角显著降低至50°以下。随着磺化程度的增加，水接触角逐渐下降，且当每个SF分子含55个或更多磺酸基团时，接触角稳定在约40°。 图2 天然SF薄膜和不同磺化SF衍生物薄膜的接触角变化 为了评估天然SF及磺化衍生物结合与释放FGF-2的能力，研究发现，在1000ng/mL FGF-2条件下，材料对FGF-2的结合量随磺化程度的增加而显著提升（图3A），最高磺化衍生物（每分子含70个磺酸基团）的结合量（95.2±2.2%）达到天然SF（48.5±15.1%）的两倍，且结合总量与磺酸基团数量呈线性正相关（图3B）。在释放行为方面，所有材料均表现出极高的FGF-2保留能力，超过99%的结合量在6天内未被释放（图3C），并且其释放速率与磺化程度呈明显的线性负相关，即磺化程度越高，释放量越低（天然SF释放0.79%，而最高磺化样品仅释放0.20%）（图3D），且在3天后释放基本达到平台期。这些结果表明，磺化修饰能有效且可预测地增强SF对FGF-2的结合能力并实现其持续、可控的滞留。 图3 天然SF及磺化衍生物结合与释放FGF-2的能力 为了探究FGF-2的状态（游离态与结合态）对细胞行为的影响，本研究首先比较了它们对人骨髓间充质干细胞（hMSCs）代谢活性的作用。研究发现，在培养至第9天时，游离态FGF-2会导致hMSCs的代谢活性出现显著且浓度依赖性的下降（100 ng/mL与1000 ng/mL FGF-2分别下降23.5±8.4%与29.2±2.4%）（图4A, 4B）。与之相对应，当FGF-2结合在最高磺化度的SF衍生物薄膜（70个磺酸基团/分子）上时，也观察到了类似的代谢活性抑制效果（下降34.9±6.1%与32.6±4.1%），其下降幅度与游离态FGF-2无显著差异（图4A, 4B）。该结果表明，磺化SF材料不仅能有效结合FGF-2，而且能保留其关键的生物活性，使其能够以与游离生长因子相似的方式调控细胞的代谢功能。 图4 游离态与结合态FGF-2对细胞代谢活性的影响 在明确了结合态与游离态FGF-2均能抑制细胞代谢活性的基础上，进一步探究了不同磺化程度的SF衍生物对这一效应的调控作用。结果表明，材料本身的磺化程度是决定hMSCs代谢活性的关键因素：无论FGF-2存在与否，中等磺化程度（每分子含20-40个磺酸基团）的薄膜均能支持最高的细胞代谢活性（图5A, 5B），其中无FGF-2时以40个磺酸基团的样品为最佳，而有FGF-2时则以20个磺酸基团的样品为高。相比之下，天然SF薄膜上的细胞活性始终最低。当重点关注FGF-2的生物活性时，数据显示，结合在磺化SF薄膜上的FGF-2在第9天同样引起了约三分之一的代谢活性显著下降（图5C），这一抑制效果与游离FGF-2的趋势高度一致，且在所有磺化衍生物上均观察到该现象，再次证实了磺化SF能有效维持所结合生长因子的生物功能。 图5 不同磺化程度的SF衍生物对细胞代谢活性的调控作用 为了从信号通路层面验证FGF-2的活性，本研究进一步分析了其对hMSCs中ERK1/2磷酸化（pERK1/2）水平的影响。研究发现，与代谢活性的结果相呼应，游离态FGF-2（100 ng/mL）能显著激活MAPK信号通路，使pERK1/2水平提升51.6±13.6%（图6A, 6B）。至关重要的是，当FGF-2结合在最高磺化度的SF薄膜（70个磺酸基团/分子）上时，同样能诱导pERK1/2水平出现幅度相似的显著增强（提升46.1±12.2%与44.1±5.3%）（图6A, 6B）。该结果明确证实，磺化SF不仅能保留FGF-2对细胞代谢的调控功能，更能有效维持其激活下游关键信号通路的生物效能，从而在分子水平上证明了此递送系统在保持生长因子完全生物活性方面的成功。 图6 游离态与结合态FGF-2对hMSCs中ERK1/2磷酸化水平的影响 进一步评估了SF磺化程度对FGF-2诱导pERK1/2水平的影响。结果显示，存在一个明确的磺化程度阈值：只有当FGF-2结合于磺化度不低于40个磺酸基团/分子的SF薄膜时，才能显著提升hMSCs的pERK1/2水平（图7A）。具体而言，含40与70个磺酸基团的衍生物薄膜分别使pERK1/2水平增加了26.2±4.0%与30.5±6.0%（图7B），而含55个基团的薄膜也呈现出强烈的上升趋势。相比之下，FGF-2结合在天然SF或低磺化度（20个基团/分子）的衍生物上，则未能引发pERK1/2水平的显著变化。此结果从信号通路层面精确界定：只有达到足够磺化程度（≥40）的SF材料，才能有效维持所结合FGF-2的完全生物活性，从而确保其对细胞行为的正确调控。 图7 SF磺化程度对FGF-2诱导pERK1/2水平的影响 结论 本研究成功开发了一系列磺化丝素蛋白衍生物，能够通过非共价作用高效结合FGF-2，并实现其持续保留与可控释放。磺化SF材料不仅提高了FGF-2的负载能力，还保留了其生物活性，表现为对hMSCs代谢活性的调控和ERK信号通路的激活。该研究为开发ECM仿生材料提供了新策略，尤其在生长因子递送系统和组织再生领域具有广泛应用潜力 原文链接：https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2009.11.006 |
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