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[交流] 做CRISPR文库筛选之前你需要知道哪些？一文给你解答

众所周知，CRISPR 文库筛选是基于 CRISPR 基因编辑技术的大规模功能基因筛选方法，核心是通过 “海量 sgRNA（向导 RNA）组成的文库” 对细胞进行大规模基因编辑，再结合特定表型筛选，从基因组中快速找到与目标生物学过程相关的关键基因。

其核心逻辑可概括为 “编辑 - 筛选 - 鉴定” 三步：先将覆盖全基因组或特定基因集的 sgRNA 文库导入细胞，实现对大量基因的同时编辑（敲除、激活或抑制）；接着根据研究目标（如细胞存活、耐药性、荧光信号等）筛选出具有特定表型的细胞群体；最后通过测序分析筛选后细胞中 sgRNA 的富集或缺失情况，反向推断出调控目标表型的关键基因。

如果你是刚接触功能基因组学研究的科研人员，或是想通过 CRISPR 文库筛选挖掘关键基因的研究者，大概率会在实验设计初期陷入 “该选哪种筛选方式”“文库类型怎么匹配研究目标” 的困惑里。小源今天就给大家讲讲，在开展CRISPR文库筛选实验之前，需要对哪几个方面进行全面地了解。

一、CRISPR 文库筛选能解决哪些研究问题？

根据CRISPR 文库筛选的原理，它的应用场景可以说几乎覆盖了基础科研和转化医学的大部分领域，常见的有这几类：

1. 疾病机制研究：找 “致病关键基因”

不管是肿瘤、神经退行性疾病，还是代谢疾病，都能通过文库筛选挖掘核心驱动基因。比如在肿瘤研究中，用癌细胞系做筛选，能找到 “敲除后癌细胞就无法增殖” 的必需基因，这些基因可能就是潜在的治疗靶点；在病毒感染研究中，筛选 “敲除后细胞能抵抗病毒入侵” 的基因，能发现病毒依赖的宿主因子，为抗病毒药物研发提供方向。

2. 药物研发：找 “耐药 / 敏感基因”

这是文库筛选最常用的场景之一。想知道某种化疗药为什么会出现耐药？可以用耐药细胞和敏感细胞做对比筛选，找到 “敲除后细胞就对药物耐药” 的基因；反过来，想找能增强药物疗效的基因，也能通过筛选发现 “敲除后药物杀伤效果翻倍” 的靶点，为联合用药提供依据。

3. 细胞功能研究：解析 “生物学过程的基因网络”

比如想搞清楚细胞自噬、细胞凋亡、干细胞分化这些过程涉及哪些基因，就可以针对特定表型（如 “自噬体形成”“细胞凋亡率升高”）做筛选。比如筛选 “敲除后细胞自噬被抑制” 的基因，就能构建出自噬相关的基因调控网络，帮你理清信号通路的上下游关系。

4. 合成致死筛选：为 “精准治疗” 找突破口

合成致死的核心是 “两个基因同时敲除会导致细胞死亡，但单独敲除一个不会”。这种筛选特别适合肿瘤治疗，比如针对携带 BRCA 突变的肿瘤，筛选 “敲除后能和 BRCA 突变产生合成致死效应” 的基因，这些基因就是 BRCA 突变肿瘤的特异性靶点，能实现 “只杀癌细胞，不伤害正常细胞” 的效果。

二、正向筛选和负向筛选该怎么选？

很多人在筛选初期最容易搞混的就是 “正向” 和 “负向”，其实判断逻辑很简单：看 “筛选后存活的细胞” 里，目标基因是 “被保留” 还是 “被淘汰”，再结合你的研究目标来匹配。

先记住一个核心原则

1. 正向筛选：找 “促进目标表型” 的基因

• 敲除该基因，目标表型消失

• 保留该基因，细胞能存活 / 获得目标表型

2. 负向筛选：找 “抑制目标表型” 的基因

• 敲除该基因，目标表型出现

• 该基因存在时，细胞会死亡 / 无法获得目标表型

具体场景对应

1. 正向筛选：适合 “找必需 / 优势基因”

当你的研究目标是 “找到让细胞获得某种优势（如耐药、增殖），或完成某个必需过程（如存活、分化）的基因” 时，就选正向筛选。

举几个例子：

• 场景 1：筛选某靶向药的耐药基因。用药物处理细胞后，只有 “敲除了耐药基因” 的细胞能存活下来，这些存活细胞里的 sgRNA（对应耐药基因）会被富集，通过测序就能找到耐药基因 —— 这就是正向筛选，因为目标基因（耐药基因）在存活细胞中被保留了。

• 场景 2：找肿瘤细胞的增殖必需基因。敲除某个基因后，如果癌细胞无法增殖就会死亡，只有 “没敲除必需基因” 的细胞能存活，存活细胞里的 sgRNA 对应就是增殖必需基因 —— 这也是正向筛选，目标基因（必需基因）被保留。

2. 负向筛选：适合 “找抑制 / 毒性基因”

当你的研究目标是 “找到抑制细胞存活，或抑制某种优势表型的基因（如肿瘤抑制基因、毒性基因）” 时，就选负向筛选。

比如：

• 场景 1：筛选肿瘤抑制基因。肿瘤抑制基因的作用是 “抑制细胞癌变”，敲除它之后，细胞会获得增殖优势，在筛选中存活下来；而没敲除它的细胞，增殖受抑制，会被淘汰。这时存活细胞里 “缺失” 该基因的 sgRNA，通过对比就能找到它 —— 这就是负向筛选，目标基因（抑癌基因）在存活细胞中被淘汰了。

• 场景 2：找毒性基因。有些基因表达后会对细胞产生毒性，敲除它之后细胞能存活；而没敲除的细胞会因为毒性死亡。这时存活细胞里 “缺失” 该毒性基因的 sgRNA，这也是负向筛选。

快速判断小技巧

筛选前问自己两个问题：

1. 我想找的基因，功能是 “帮细胞活” 还是 “让细胞死”？

• 帮细胞活（必需 / 耐药 / 增殖）→ 正向筛选；

• 让细胞死（抑制 / 毒性 / 抑癌）→ 负向筛选。

1. 筛选后存活的细胞，应该 “有” 还是 “没有” 这个基因？

• 有该基因才能活 → 正向筛选；

• 没有该基因才能活 → 负向筛选。

不管您是正向筛选还是负向筛选，都能为您提供全流程精细化服务。源井生物的多样化表型分析平台可支撑多种功能筛选体系所需，全面覆盖药物/病毒处理、传代培养、细胞共培养、流式分选、细胞迁移和贴壁等筛选操作。不止体外筛选，还提供还原体内真实环境的体内筛选，体内+体外双重保障，靶基因无处可逃。

三、常用的 3 类 CRISPR 文库筛选类型

文库类型直接决定了基因编辑的效果，不同的研究目标要匹配不同的文库，常见的有 3 类：敲除文库（CRISPR-KO）、激活文库（CRISPRa）、抑制文库（CRISPRi），它们的核心区别在于 “对基因表达的影响”。

1. 敲除文库（CRISPR-KO）

原理

通过 sgRNA 靶向基因的外显子区域（尤其是起始密码子附近），结合 Cas9 蛋白造成 DNA 双链断裂，细胞在修复过程中会出现移码突变，导致基因无法正常表达，实现 “基因敲除”。

适用场景

几乎所有需要 “灭活基因” 的筛选，比如找增殖必需基因、耐药基因、肿瘤抑制基因、病毒依赖的宿主因子等。比如前面提到的 “筛选肿瘤细胞增殖必需基因”“筛选药物耐药基因”，大多用的是敲除文库。

优势

• 效果彻底：能直接让基因失去功能，表型更明显；

• 应用范围广：不管是编码基因还是非编码基因，都能筛选；

• 技术成熟：市面上有很多商业化文库（如 GeCKO、Brunello 文库），实验流程稳定。

拥有超40种现货CRISPR文库质粒，包括GeCKO、Brunello 文库，品类齐全、覆盖广泛，支持即买即用，缩短实验准备周期。同时支持多类型文库载体定制，提供多种抗性标记与荧光标签选项，灵活匹配不同实验体系和筛选策略。

2. 激活文库（CRISPRa）

原理

这类文库的 sgRNA 不靶向基因编码区，而是靶向基因的启动子或增强子区域，再结合 “dCas9 - 激活因子融合蛋白”（比如 dCas9-VP64、dCas9-SAM），通过激活因子结合调控区域，促进基因转录，实现 “基因激活”。

适用场景

想找到 “激活后能产生特定表型” 的基因，比如：

• 筛选 “激活后能让癌细胞凋亡” 的抑癌基因；

• 筛选 “激活后能增强细胞对药物敏感性” 的基因；

• 研究干细胞分化中，“激活后能诱导分化” 的关键转录因子。

优势

• 不破坏基因结构：只是上调表达，适合研究 “基因过表达” 的效应；

• 适合难敲除的基因：有些基因敲除后细胞会死亡，无法筛选，这时用激活文库能观察过表达的表型。

3. 抑制文库（CRISPRi）

原理

和激活文库类似，使用的是 “dCas9 - 抑制因子融合蛋白”（比如 dCas9-KRAB），sgRNA 靶向基因的启动子或转录起始位点附近，抑制因子结合后会阻止 RNA 聚合酶结合，从而抑制基因转录，实现 “基因抑制”。

适用场景

想 “部分降低基因表达” 来观察表型，尤其是针对 “敲除后细胞致死” 的必需基因。比如：

• 研究 “部分抑制后能影响细胞增殖” 的必需基因（敲除会致死，无法筛选，抑制就能观察到表型）；

• 筛选 “抑制后能增强药物疗效” 的基因（不需要彻底敲除，降低表达就能起效）。

优势

• 可逆且可控：抑制效果可以通过调控 sgRNA 的表达来控制，不像敲除那样不可逆；

• 特异性高：只抑制目标基因的表达，不会影响其他基因；

• 适合必需基因：避免了敲除必需基因导致细胞死亡的问题。

基于自主研发的CRISPR-iScreen™技术，可提供CRISPR-KO、CRISPRa、CRISPRi三大定制文库从高通量sgRNA文库构建到病毒包装、细胞转染、药物筛选、高通量测序和数据分析等一站式服务，多种交付方式满足不同科研需求。

四、筛选前先确认三个问题

在确定实验方案前，不妨先问自己这 3 个问题，能帮你进一步明确方向：

1. 我的研究目标是 “找让细胞活的基因” 还是 “找让细胞死的基因”？（确定正 / 负向筛选）

2. 我需要 “彻底灭活基因”“上调表达” 还是 “下调表达”？（确定文库类型）

3. 我的筛选表型是 “细胞存活 / 增殖”“药物敏感性” 还是 “特定分子表型（如荧光信号）”？（确定筛选方法和检测指标）

想清楚这 3 个问题，CRISPR 文库筛选的核心框架就基本清晰了。后续再根据细胞类型、筛选规模（全基因组 vs 亚库）、测序平台等细节调整方案，就能少走很多冤枉路。

拥有400种现货文库细胞，涵盖多种肿瘤和常用细胞系。交付周期短，快至1周，节省前期构建时间。拥有包括人、小鼠、绿猴、猪在内的多个物种，更有全基因组文库、亚文库多样化的筛选规模供您选择。

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1楼2025-12-02 14:42:44

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