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科研战神来了新虫 (小有名气)
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实验技术分享 | 手把手教你成骨细胞茜素红ARS染色（实用版）
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一、备品 1. 我用的成骨细胞MC3T3，如果是原代，可以参考我的步骤。MC3T3有两种分型，24型侧重增殖，14型侧重成骨分化，强烈建议选择4/5代的MC3T3-14型细胞进行试验，成功率高。 2. 用十二孔板做，换液方便，拍照也方便，容易出现差异结果。 3. 成骨诱导剂我是自己配的，用的我师兄的配方，此处作为引用：含10%FBS的αMEM培养基500ml + 抗坏血4.40mg + B-甘油磷酸二钠1.53g + 地塞米松0.0196mg。这个试剂用量太微小，可以先配母液50ml（五瓶用量，每瓶500ml培养基加10ml），40ml纯水 + 22mg抗坏血酸 + 7.65g B-甘油磷酸二钠 +0.098mg 地塞米松（地米需溶于无水乙醇，25ml无水乙醇 + 100mg地塞米松，每瓶取5微升，也就是上述母液50ml加25微升地米母液）。 4. 成骨诱导液配好后，过三遍0.22的滤膜，然后冻到负二十，如果冻存超过一周，解冻后建议再次过滤，过滤后再加入培养基里。 5. 染液我用的OriCell的，确实好用，当然，这只是参考，大家爱用啥用啥。 二、操作1. 首先，我用0.1%明胶包被了板子（成品明胶溶液稀释后，十二孔板，每个空一毫升，四周缠封口膜，扔细胞箱里四小时，然后把液体吸走，再铺板），好处是细胞及其耐造，基本不会卷边，不会飘。缺点是明胶容易粘一些杂质，什么棉花丝之类的，不干净，而且高倍镜拍照的时候麻麻赖赖不光滑。建议稀释好的明胶过两次0.22滤膜再铺板。 2. 细胞铺板浓度随意，差不多就行，因为养到最后都是满满的，建议浓度是铺进去第二天就能长到100%。但是必须确保细胞状态良好无污染，黑胶虫和支原体都是致命的，务必确认。 3. 换液最讲究，请严格按我说的做。 (1) 第一阶段（1周）：铺板24H后第一次换液，十二孔板（下同）每孔2ml。建议用不加诱导剂的培养基，有条件可以使用加可乐必妥的培养基（确保清除支原体），再次培养3-5天（隔天换半量液体，确保细胞完全长满，而且没有支原体/黑胶虫污染）。 (2) 第二阶段（2-3周）：此阶段第1周根据细胞情况，加入正常培养基和诱导培养基1:1混合后的混合培养基，第2周及以后全部换为诱导培养基。基本原则，隔天换液，每次半量，观察培养基，如果颜色不是淡粉色，变成透明黄色，那不用等隔天换液，应该立即换液（说明培养基没有营养了）。此阶段细胞大量增殖分化，需要勤观察，勤换液。一旦营养不足，细胞老化凋亡，实验失败；一旦死细胞堆积，极其容易引起真菌感染，实验失败；一旦换液力度过大还没有包被，膜翘边打卷，实验失败。这个阶段离成骨还有距离，如果感觉细胞表面不干净，该冲洗冲洗，不用怕。 (3) 第三阶段（1-2周）：实验冲刺阶段，也是成骨关键阶段，标志为成骨细胞增殖结束，开始分化，直观表现为培养基隔天换液时，旧的培养基仍然保持淡粉色，不会变为淡黄透明，意味着细胞旺盛分裂停止，基本不会一两天就把营养消耗完。此时也是成骨的开始，立刻停止频繁换液，不然会影响细胞成骨，因为频繁换液一是破坏培养基酸碱平衡，二是会冲走表面生成的一丢丢钙。此阶段直接每孔加入2.5-3ml诱导培养基（基本加满），然后注意观察就可以，不用严格隔几天换液，只要培养基整体是粉色，细胞状态不变，就不用换液，如果不放心，可以三到四天换1ml，不论吸取还是打入，动作一定轻柔，不要碰到底部。 三、判断1. 什么时候开始成骨？细胞表面出现模糊影，高倍镜下，部分细胞内有区别于凋亡小体的小透明圆球。 2. 什么时候能染出颜色？肉眼见皿底部有团块状云雾影，镜下感觉有团块状物体覆盖在细胞表面，不是死细胞，是由没有细胞结构的小点点组成。 3. 怎么判断污染？(1) 支原体污染：细胞触角拉长，高倍镜下，膜表面有黑点。处理方法：可以尝试用支原体清除剂+可乐必妥处理。 (2) 黑胶虫污染：细胞不贴壁，大量漂浮，培养基迅速变黄，高倍镜下密密麻麻会动的小黑点。处理方法：板子直接扔掉，重新做。 (3) 真菌感染：多发生在加诱导培养基之后，死细胞过多，孔板内培养基中出现云雾状悬浮物，细胞大量死亡，旋转晃动板子，云雾状会聚集到中央。处理方法：诱导初期，隔一段时间彻底换液，轻轻洗一下细胞，一旦已经污染，建议直接拿去染ALP，或者扔掉，继续养会传染别的细胞。 四、染色拍照1. 如果镜下观察到了大量钙结节，那么恭喜你，可以染色了。 (1) 首先，轻柔吸去培养基（决不允许倒扣甩干培养基，把钙结节都甩飞了） (2) 不用洗！也不用固定！ 直接贴壁轻柔加入ARS染液200-500微升/孔（不要大力，更不能对着皿底大，不然会把膜和钙结节吹坏，白干了）。如果成功，会在一两分钟内迅速看到初步的钙结节染色，但是别急，等二十分钟，然后轻柔吸出染液，这时候能看出红色点点/团块就是钙结节，不过背景不干净，都是红色。 (3) 轻柔贴壁加入ddH2O（不许用别的，就用超纯水），500微升/孔，等2-5分钟，吸去，背景就变得干净了。 2. 拍照我建议留两种图片，一种是用打光板拍整体板子照片，还有完整单个孔照片，另一种是倒置显微镜下4X或者10X照片。 3. 最后把板子阴干，必要的时候可以复水重拍。 |
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