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细胞消化的完整流程与步骤
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消化前的细胞观察：什么时候该"动手"？👀 首先，我们需要学会判断细胞何时需要消化。这就像判断植物什么时候需要换盆一样重要！ 观察细胞密度：当细胞融合度达到80-90%时，就是消化的最佳时机。过密会导致细胞接触抑制，过疏则会浪费培养基资源。 检查细胞形态：健康的细胞形态饱满，贴壁牢固。如果发现细胞开始堆叠、变圆或出现大量悬浮细胞，就是"超负荷"的信号了！🚨 培养基颜色变化：若培养基从红色变为橙黄色，说明pH值已改变，细胞代谢产物增多，也是传代的提示。 💡专业小提示：不同细胞系的适宜融合度不完全相同，HeLa细胞可以等到90%，而一些原代细胞在70-80%就需要消化了哦！ 消化液的明智选择：不同细胞"口味"不同🧬 选对消化液就像选对护肤品一样重要！不同的细胞对消化液有不同的"偏好"： 胰蛋白酶(Trypsin)：最常用的消化剂，0.25%浓度适合大多数细胞系，消化力较强。 胶原酶(Collagenase)：更温和，特别适合原代细胞和敏感细胞系。 Accutase：温和型消化剂，对干细胞和神经细胞特别友好，但价格较贵。 胰蛋白酶-EDTA：添加EDTA可以螯合Ca²⁺和Mg²⁺，帮助打断细胞间连接，提高消化效率。 🌟储存小贴士：消化液一般需要-20℃保存，使用前需提前解冻至室温。千万别反复冻融，会降低活性！我通常会将消化液分装成小份，用多少取多少～ 消化步骤详解：从入门到精通🔍 1. 准备工作 提前30分钟将消化液和PBS从冰箱取出至室温（温度太低会降低消化效率且刺激细胞） 观察显微镜下细胞状态，确认需要消化 打开超净工作台，紫外灯消毒15分钟后关闭，风机运行10分钟 2. 移除旧培养基 轻轻倾斜培养瓶，用吸管从角落吸取培养基（避免直接冲击细胞层） 注意不要用吸管尖端碰触到贴壁的细胞，以免损伤细胞层 3. PBS洗涤步骤 沿培养瓶壁轻轻加入适量PBS（25cm²培养瓶约3-5ml） 轻轻摇晃，确保PBS覆盖整个生长面 倾斜培养瓶，从角落吸出PBS 重复洗涤1-2次，彻底清除血清残留（血清会抑制胰蛋白酶活性！）💦 4. 消化液添加与操作 加入适量预温的消化液（25cm²培养瓶通常1-2ml即可） 确保消化液均匀覆盖所有细胞 放入37℃培养箱中孵育（大多数细胞1-3分钟） 轻拍培养瓶侧壁加速细胞脱壁 在显微镜下观察细胞形态变化，当细胞由扁平状变圆并开始漂浮时，说明消化完成✨ 5. 终止消化反应 迅速加入含血清的完全培养基（血清中的成分可抑制胰蛋白酶活性） 加入量通常为消化液的3-5倍 轻轻吹打细胞层，使细胞完全脱离瓶壁 反复吹打5-10次，打散细胞团块，获得单细胞悬液 💡贴心提醒：HeLa细胞消化通常只需1-2分钟，CHO细胞约2-3分钟，而原代成纤维细胞可能需要5-8分钟。千万别超时，否则细胞活性会大大降低哦~ 消化过程中的关键注意事项⚠️ 温度控制：消化液和PBS最好预温至室温，冰冷液体会刺激细胞，导致死亡率上升。 时间把握：过长的消化时间会降低细胞活性，过短则细胞不易完全脱壁。 细胞形态变化：正常消化过程中，细胞会从贴壁状态变为圆形悬浮状态，边缘变得明亮。 吹打力度：力度要适中，过轻无法分散细胞团，过重会导致机械损伤。 消化液选择：敏感细胞最好选用温和型消化液，耐受性强的细胞可用常规胰蛋白酶。 🔍细节决定成败：当你用显微镜观察到90%以上的细胞已经变圆并开始漂浮，但还有少量细胞轻轻贴附在表面时，正是终止消化的最佳时机！ 毕合生物(www.bihebio.com)提供服务内容：分子生物学、免疫, 重组蛋白及ELISA相关、活性小分子化合物、高端化学、材料化学、细胞资源库与培养相关、生命科学、天然产物 |
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