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【Commun. Chem.】生物催化动力学拆分用于δ-卤代醇与四氢呋喃类化合物的合成
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导语 手性δ-卤代醇与四氢呋喃是多种药物分子（如抗精神病药物和大环内酯类抗生素）的关键结构单元。然而，传统化学合成方法通常依赖贵金属催化剂与苛刻反应条件，对映选择性控制难度大；而现有生物催化策略（如酮还原酶）在实现远程立体控制方面效率有限。卤醇脱卤酶（hhdh）虽具备催化杂泛性，但其应用长期受限于β-卤代醇体系。如何突破其催化边界，实现δ-卤代醇的高效、高选择性转化，一直是该领域的重要挑战。遵义医科大学万南微课题组一直致力于卤醇脱卤酶生物催化技术研究，研究团队前期已成功将卤醇脱卤酶的催化功能拓展至γ-卤代醇的立体选择性脱卤及氧杂环丁烷的选择性开环（nat. commun., 2025, 16, 1170），详见往期报道：https://mp.weixin.qq.com/s/9o2zdupkwq9lf3mzjlicqw。  在上述研究基础上，团队进一步探索了卤醇脱卤酶在δ-卤代醇动力学拆分中的合成潜力。通过酶筛选与蛋白质工程改造，成功开发了一种高效的生物催化动力学拆分新方法，实现了手性δ-卤代醇与四氢呋喃类化合物的对映选择性互补合成。值得关注的是，该生物催化体系在放大反应中可耐受高达1000 mm（185 g/l）的底物浓度，展现出优异的工业化应用前景。该研究成果以“biocatalytic kinetic resolution for efficient and enantioselective synthesis of δ-haloalcohols and tetrahydrofurans”为题，近期发表于communications chemistry（commun. chem., 2025, 8, 337, doi:10.1038/s42004-025-01713-w）。研究生王远飞、华夏为共同第一作者，课题组王慧慧老师为共同通讯作者。  图1. 卤醇脱卤酶催化混杂性及其合成应用（图片来源：commun. chem.） 前沿科研成果 作者首先以催化外消旋4-氯-1-苯基-1-丁醇（1a）转化为目标反应，对实验室保藏的多种重组野生型卤醇脱卤酶（hhdh）进行了系统评估，筛选范围覆盖a╟g组共38种酶。结果显示，大多数酶的催化活性较低，仅有8种酶的转化率超过10%，且产物的对映选择性处于中低水平，生成的r型或s型2-苯基四氢呋喃（1b）光学纯度介于62%╟89% ee。值得关注的是，来自农杆菌（agrobacterium tumefaciens）ad1菌株的hhec酶表现最为突出，转化率达59%，并展现出当前最优的对映选择性（e=20）。基于此，作者进一步评估了实验室已构建保存的17个hhec突变体。其中hhec-sm4 (t134l)、hhec-tm2 (f86v/t134v/n176g) 和 hhec-qm1 (p84v/f86p/t134a/n176a)三个优良突变体在对映选择性方面获得显著提升。特别是四点突变体hhec-qm1，在催化活性和r型对映选择性方面表现尤为优异（e > 200）。该突变体在仅15分钟的反应时间内，即可实现20 mm外消旋底物1a的48%转化，生成产物(r)-1b的光学纯度高达99% ee，剩余底物(s)-1a也达到92% ee。进一步的底物谱研究显示，hhec-qm1对15种不同结构的δ-卤代醇均表现出良好的催化兼容性，涵盖芳环、杂环（如噻吩）及烷基取代等多种类型。大部分底物在转化后产物收率介于39%╟50%，光学纯度达86%╟>99% ee，其中芳环类底物的对映选择性最优。值得注意的是，即使面对萘环或α,α-二取代等空间位阻较大的底物，该酶仍能实现有效转化，展现出广泛的底物适用性。  图2. 卤醇脱卤酶的筛选及r-对映选择性脱卤底物适用范围（图片来源：commun. chem.） 随后，作者进一步结合多维突变位点分析与分子对接模拟，揭示了卤醇脱卤酶hhec催化活性与对映选择性之间的协同调控机制：酶分子中卤离子结合区域（n176-y177-l178等残基）负责识别并结合底；而底物结合区域（如p84、f86等残基）则借助疏水作用与芳香相互作用稳定底物取代基，从而调控其结合取向。两个区域的协同作用共同实现了对δ-卤代醇脱卤反应效率及立体选择性的精准控制。  图3. δ-卤代醇脱卤反应机理分析（图片来源：commun. chem.）  图4. 基于酶结构的对映选择性分析（图片来源：commun. chem.） 为实现δ-卤代醇的对映互补性脱卤反应，研究团队聚焦于通过蛋白质工程改造hhec-wt，旨在提升其s型对映选择性。基于对酶催化机制的深入理解，团队针对p84、f86、t134、w139、n176和w249等关键残基开展了系统的位点饱和突变研究。在t134位点的筛选中，研究确认了已知突变体hhec-sm4（t134l）具有增强的对映选择性。然而，进一步在该位点构建的17个新突变体均未表现出更优性能。与此同时，从f86和n176的突变库中分别鉴定出两个有益单点突变体：hhec-sm11（f86w）与hhec-sm12（n176q）。其中，hhec-sm11表现出优异的对映选择性（e=111），在催化20 mm外消旋底物1a时实现48%转化率，分别获得95% ee的(s)-1b和87% ee的(r)-1a。作者进一步通过定点突变构建了三个双点突变体：hhec-dm9（f86w/t134l）、hhec-dm10（f86w/n176q）和hhec-dm11（t134l/n176q）。然而，这些双点突变体在催化效率与对映选择性方面均未超越hhec-sm11。随后，作者系统评估了这些s-对映选择性酶在多种δ-卤代醇底物中的适用性。为验证合成工艺的可放大性，研究以hhec-sm11全细胞作为s-选择性生物催化剂，开展了代表性制备规模反应，成功获得手性(s)-四氢呋喃（产率43%╟49%，88%╟95% ee）与手性(r)-δ-卤代醇（产率39%╟49%，90%╟>99% ee），充分证明了生物催化法实现四氢呋喃与δ-卤代醇对映互补合成的可行性。  图5. s-对映选择脱卤酶的改造及其底物谱研究（图片来源：commun. chem.） 最后，作者进一步验证了该生物催化技术的工艺适用性。在500 mm底物浓度下，突变体hhec-qm1反应24小时可实现45%转化率；通过调控反应ph（维持ph 8.0±0.1），即使在1000 mm（185 g/l）超高浓度下反应20小时，仍保持e > 200，产率达48%╟49%，并保持优异的光学纯度（95%╟97% ee），展现良好的工艺稳定性与可放大潜力。此外，合成所得手性δ-卤代醇可进一步转化为多种高价值衍生物，如用于神经胶质瘤治疗的mrjf4类似物前体、一氧化氮合酶抑制剂前体等，凸显了该生物催化技术在药物中间体绿色合成中的广阔应用前景。  图6. 该生物催化技术的合成实用性与可放大性（图片来源：commun. chem.） 综上所述，本研究中作者通过酶筛选与蛋白质工程成功构建了一种高效生物催化平台，可用于动力学拆分合成手性δ-卤代醇与四氢呋喃类化合物，该平台展现出优异的底物耐受性、广泛的底物普适性及高度的对映选择性。该工作不仅进一步拓展了卤醇脱卤酶的催化功能与应用范围，还通过反应机制分析揭示了酶结构与其催化功能之间的关系，为后续卤醇脱卤酶的理性设计与定向改造提供了可借鉴的理论依据。 论文信息 yuan-fei wang#, xia hua#, zhang-yang wang, xiao jin, hui-hui wang*, yong-zheng chen & nan-wei wan*. biocatalytic kinetic resolution for efficient and enantioselective synthesis of δ-haloalcohols and tetrahydrofurans. commun. chem., 2025, 8, 337. https://doi.org/10.1038/s42004-025-01713-w. |
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