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脱矿质牙本质基质混合水凝胶衍生的优异牙槽骨移植替代物已有1人参与

研究背景：
骨移植替代材料常用于修复大面积骨缺损，而恢复牙槽骨缺损的高度和宽度是牙科修复面临的主要挑战。与牛源骨粉、羟基磷灰石等临床常用骨移植替代材料相比，脱矿质牙本质基质（DDM）因其成分与人体骨骼相似，成为极具价值的替代方案。然而，DDM在骨修复中的应用仍面临挑战，其颗粒形态难以维持空间形态。为此，浙江省人民医院口腔医学中心杨帆教授等人开发了一种高效骨移植替代材料：将DDM颗粒嵌入快速固化的丝素蛋白/透明质酸甲基丙烯酸酯（SF/HAMA）水凝胶中，该材料克服了传统HA衍生水凝胶机械强度差的缺陷，能与牙槽骨缺损区紧密结合，并在蓝光照射下快速凝胶化，在大鼠颅骨和犬下颌骨缺损模型中表现出优异的再生修复能力。

图1 复合骨移植替代物的制备及修复骨缺损的示意图

研究内容：

图2 SF/HAMA复合水凝胶的性能研究
1.SF/HA/DDM骨移植替代物的合成与表征：图2A氢谱结果可以看出，与SF相比，SF-GSH在2.17、2.56、2.93和2.95 ppm处的特征峰表明GSH已成功与SF共价键合。其中，位于2.93和2.95 ppm的峰对应GSH中连接到硫醇基团的亚甲基，GSH的取代度为17.99%。在HAMA氢谱中可以看到微弱的衍射峰，出现在1.8ppm、5.6和6.1ppm，对应于MA的特征峰，表明MA已成功接枝到HA主链上，经计算MA的取代度为48%。
通过硫醇-烯点击反应制备SF/HAMA水凝胶，并在蓝光下进行快速交联。如图2B所示：通过调整HAMA与SF-GSH的质量比，制备了交联度可调的水凝胶，命名为SF-25(25%SF，75%HAMA)、SF-33(33%SF，67%HAMA)和SF-50(50%SF，50%HAMA)。图2C的SEM和孔径分布图显示，冷冻干燥后的SF/HAMA水凝胶都具有均匀、开放的孔道结构。考虑到高孔隙率和大孔径对成骨能力的改善，因此选择SF-25进行后续实验。
观察DDM的结构可以发现牙本质小管分布均匀，孔径约为2 μm（图2D）。DDM的物相分析光谱显示脱矿后其主要成分为羟基磷灰石（图2E）。SEM观察表明，SF-25与DDM混合后，水凝胶保持了其多孔结构，牙本质小管和孔洞在DDM上均匀排列(图2F)。如图2G所示，压缩弹性系数反映SF-25、SF-33和SF-50的机械强度分别为0.38、0.24和0.18 Mpa。而DDM添加量会导致压缩强度降低，SF/HAMA/DDM-15、SF/HAMA/DDM-35和SF/HAMA/DDM50的抗压强度分别为90、43和29 kPa(图2H)。
SF/HAMA水凝胶在PBS中30分钟内达到溶胀平衡，溶胀速率约为30wt%(图2I)，并在整个测试过程中保持其初始形状，表明其物理和化学稳定性适合作为骨移植替代品。此外，由于交联大分子链的快速和突然断裂而导致的不可控制的快速降解，是影响骨缺损的修复的主要原因。而图2J表明SF/HAMA水凝胶的降解率可控，21天的降解率为17.34%，适合作为骨组织再生的骨移植替代物。

图3 SF/HAMA复合水凝胶的生物相容性
2.生物相容性评价：将SF-25水凝胶与DDM粒子按15%、35%和50%的质量比共混，制备了SF/HAMA/DDM复合材料。细胞活/死染色证实了复合水凝胶与细胞共培养后牙周膜干细胞能保持良好的活性（图3A）。图3B划痕试验说明SF/HAMA/DDM-35和SF/HAMA/DDM-50组表现出更强的迁移活性和促愈合能力。图3D中的统计结果表明，SF/HAMA在一定程度上可以促进细胞迁移。此外，DDM的加入具有协同作用，进一步促进了划痕愈合。CCK-8试验证明了水凝胶的低细胞毒性(图3C)。进而将该水凝胶植入大鼠背部皮下，1周后水凝胶被轻度降解，被纤维结缔组织包裹。水凝胶大部分残留在植入部位。与正常皮下组织相比，植入水凝胶组没有明显的炎症细胞浸润或急性炎症反应，也没有对其他组织产生毒性反应(图3E-G)。

图4 SF/HAMA复合水凝胶的促成骨能力
3.促成骨能力评价：评价骨移植生物材料性能的关键是确定其能否促进牙周膜干细胞与成骨细胞的成骨分化。图4A为牙周膜干细胞在水凝胶渗滤液中培养4天和7天后碱性磷酸酶染色的显微图像。与空白组和SF/HAMA组相比，SF/HAMA/DDM组染色面积较大，阳性面积随DDM含量增加而扩大，其中SF/HAMA/DDM-50组增加最为明显。第21天牙周膜干细胞ARS染色显示SF/HAMA/DDM-50和SF/HAMA/DDM-35组较对照组和低DDM组有更多的钙沉积，其中SF/HAMA/DDM-50显示最高的矿化效率。这些结果表明，SF/HAMA/DDM复合骨移植替代物是一种很有前途的骨组织再生材料。
图4D和E显示了复合材料在成骨过程中的基因表达。RUNX-2、ALP的表达与成骨细胞活性和成骨分化直接相关。图中分别显示了在4、7、14天的时间点内，SF/HAMA/DDM组相对于对照组RUNX-2表达上调，第7天时，ALP也显著上升。此外，在第14天，SF/HAMA/DDM组I型胶原水平明显高于对照组，说明其促进成骨细胞的黏附和发育，有助于骨的维护和修复。研究表明，骨钙素(OCN)是骨矿化阶段的标志，并可在成熟的成骨细胞中表达。在第14天，OCN、OPN（骨桥蛋白）的表达明显增加，这与骨组织矿化的增强相一致。上述实验结果初步表明，与其他组相比，骨移植替代物SF/HAMA/DDM可以促进牙周膜干细胞的增殖和成骨分化。

图5 大鼠颅骨缺损的修复实验
4.复合骨移植替代物体内修复大段骨缺损的实验研究（大鼠）：将骨移植替代物植入大鼠颅骨缺损区观察8周和16周，随后并取材进行CT扫描。图5A中空白组和DDM组未见明显的缺损区缩小趋势，仅在缺损区边缘有少量新骨形成。SF/HAMA/DDM-35组和SF/HAMA/DDM-50组在各个时间点均有较好的成骨效果，明显减少了大鼠颅骨缺损的面积。16周后，SF/HAMA/DDM-50组完全骨化，新生骨组织几乎完全覆盖缺损区。图5B~D显示SF/HAMA/DDM-35组和SF/HAMA/DDM-50组BV/Tv（新生骨量）、Tb.Th（骨小梁厚度）增加、Tb.sp（骨小梁分离度）降低，与空白组和DDM组比较有显著差异。

图6 大鼠颅骨缺损修复的组织学观察
用H&E和Masson染色检测SF/HAMA/DDM复合材料在植入大鼠颅骨缺损处后8周、16周的成骨潜能。各组骨缺损处均有纤维结缔组织填充，内含成纤维细胞和血管，空白组骨缺损处未见明显新骨形成，DDM组的DDM颗粒被纤维组织包裹，缺损区边缘仅见少量新骨形成。与空白组和阴性对照组相比，SF/HAMA/DDM-50和SF/HAMA/DDM-35组有更多的新骨形成，明显缩短了双侧骨缺损的距离。术后16周，空白组缺损处新骨仍较少，缺损处仍有大量纤维结缔组织填充。DDM组术后8周新生骨较多，未成熟编织骨与成熟骨小梁混杂，DDM颗粒部分吸收，但缺损区仍可见较多纤维结缔组织。16周时SF/HAMA/DDM-35和SF/HAMA/DDM-50组基本完全愈合，缺损区被骨组织替代，骨组织内可见血管，骨组织上覆盖纤维结缔组织。

图7 比格犬下颌骨缺损的骨修复实验
5.复合骨移植替代物体内修复大段骨缺损的实验研究（比格犬）：将骨移植替代物植入Beagle犬下颌骨缺损区4周和8周。术后4周的Micro-CT三维重建结果显示，各组骨缺损处均可见新生骨组织，但空白组有明显的缺损区，其余各组骨缺损区均可见DDM填充。8周后，空白组的缺损区较修复前缩小，但仍相对空洞。SF/HAMA/DDM-35组和SF/HAMA/DDM-50组的DDM部分被吸收，成骨更明显，缺损区有新骨填充。如图7B-D所示，在各个时间点，SF/HAMA/DDM-35和SF/HAMA/DDM-50组的BV/TV和Tb.Th均显著高于空白组和DDM组。SF/HAMA/DDM-50组的Tb.Sp最低，表明该组的新骨具有最高的骨密度。

图8 比格犬下颌骨缺损修复的组织学检测
通过H&E、Masson和Goldner染色，评价了SF/HAMA/DDM复合骨移植替代物修复比格犬下颌骨缺损的能力。如图8所示，在术后4周和8周，所有标本的缺损区均有新骨形成。大体观察结果如下：对照组在第4周时可见编织骨，8周时皮质板层骨较多，下颌骨体积明显不足。4周时SF/HAMA/DDM-35和SF/HAMA/DDM-50组以编织骨为主，8周时两组在再生区颗粒间可见较成熟的骨。上述结果表明，当DDM掺杂到水凝胶中时，可以更有效地诱导骨再生。
结论：
本研究开发了一种多功能水凝胶复合材料：SF/HAMA/DDM作为骨移植替代品，生物安全性和体内结果证实了其良好的骨再生能力，将DDM掺杂到水凝胶中时，可以更有效地诱导骨再生。SF/HAMA/DDM在修复细胞和动物水平的骨缺损方面具有良好的应用前景，可以作为大规模骨组织再生的有效替代材料。

原文链接： https://doi.org/10.34133/bmr.0243

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