[交流] 科研干货|一文带您了解石蜡切片的制作步骤与注意事项 已有1人参与

一、制作石蜡切片的具体步骤 01 取材 从新鲜组织中选取所需部分，用刀片切取合适大小组织块，组织块不宜过大。 注意取材时间不宜拖太久哦，避免组织细胞中的成分结构发生变化。 02 固定         ❶固定这一操作步骤能够快速凝固细胞内蛋白质、核酸等成分，维持细胞原有的大小、结构和排列方式。 ❷将组织块放入容器中，加入 福尔马林固定液（体积大于组织的 5倍以上倍），密封后室温放置。小组织固定 3~6 h，大组织需固定 12~24 h，确保组织细胞形态凝固、抗原稳定。 针对不同的组织类型选择不同的固定液，如动物组织一般使用福尔马林固定液，植物组织一般使用FAA固定液等。 03 洗涤         组织固定完成后，用流动的自来水冲洗30~60 min，以去除多余的固定液。 04 脱水         ❶我们知道在石蜡切片制备的过程中脱水是最关键的步骤，之所以要进行脱水处理是因为石蜡是一种脂溶性物质，无法与水混合。组织在经过固定后，内部其实还包含大量水分，这就导致导致组织与石蜡无法结合，后续的包埋和切片都会失败（比如切片时组织易碎裂、脱落）。因此，脱水步骤就基于 “相似相溶” 的特性，通过利用不同浓度的酒精（乙醇）逐步置换组织内的水分置换出来，为后续的透明和浸蜡创造条件。 ❷组织脱水需要使用梯度酒精进行处理（逐步去除水分，避免组织收缩变形）。 步骤： 70%乙醇 1 h→80%乙醇 1 h→95%乙醇 1 h→95%乙醇 1 h→100%乙醇 1 h→100%乙醇 1 h 组织越小，脱水时间越短，各浓度酒精时间可缩短 30%~50%，例如70% 酒精仅需 30~40 min，避免过度脱水导致组织变脆。如果需要过夜的话，可以停留在70%这一过程中。 特别注意：100% 酒精脱水完成后，需立即将组织移入二甲苯进行透明，不能够长时间放置在空气中。暴露在空气中会导致组织表面水分重新吸附，或因酒精过度挥发使组织干裂。 05 透明         组织经脱水后，细胞间隙装满的是酒精（水溶性有机溶剂），石蜡是脂溶性物质，无法直接与酒精互溶。透明步骤一般使用二甲苯，其既能与酒精互溶，又能与石蜡互溶，通过置换组织内残留的酒精，使组织逐渐呈现半透明状态， 这一过程能去除酒精对石蜡的 “阻隔”，还能让组织质地更均匀，使得后续石蜡能够渗入组织。 步骤： 醇苯（无水乙醇：二甲苯 =1：1）20 min→二甲苯I 20 min→二甲苯II 20 min 透明时间不宜过长（组织会变得坚硬且脆），也不宜过短（酒精未除净会导致浸蜡不充分），以组织呈半透明为判断标准。 06 浸蜡         将透明后的组织放入 65℃熔化的石蜡中，浸蜡 2~3 次（每次 1~2 h），让石蜡完全填充组织间隙，增强硬度。 07 包埋         浸蜡之后就可以进行包埋了，用镊子轻轻夹取组织，放入包埋盒，包埋的时候利用镊子对组织位置进行调整，但是如果石蜡凝固了就不要调整了，容易产生气泡。 08 切片         切片前将蜡块预冷，然后将其固定在切片机上，调整厚度至 3~6 μm。 先进行粗切，这个过程使得组织部位暴露出来；再进行细切，匀速转动手柄切成连续薄片，用毛笔轻挑切片放入 40~45℃温水中展平。 09 摊片烤片         用载玻片捞取舒展的切片，放入 65℃烤箱烤片 2 h，使切片牢固贴附，去除残留水分。 二、石蜡切片制备过程中的注意事项 01 切片上卷，没法形成连续蜡带 ❶切片刀不够锋利：可以换新刀片试试。 ❷蜡块四周留的蜡边太少：一般留 2 mm左右的石蜡；可以重新包埋蜡块，或者把蜡块四周熔化后放进包埋框补蜡，修理蜡块的时候围着组织块弄。 ❸石蜡太硬、黏度不够：要是蜡块过硬，能适当加点蜂蜡，或者换熔点低的石蜡重新包埋。 02 切片有裂纹         ❶切片刀可能存在小缺口或者刀口不平整的情况。 ❷组织里可能含有较硬的物质，比如固定液的结晶石灰质，要是组织中硬性物质太多，就不适合使用了。 ❸包埋时石蜡冻结得太慢，需要纠正包埋时的问题。 03 切片厚薄不一致 ❶切片机的微动部分失灵或齿轮跳格 这时就需要修理切片机失灵的部分，调整螺旋，给零件加机油润滑；必要时，得请专业技术人员来调整切片机。 ❷蜡块太大、太硬，导致转动的时候刀刃会受到震动 要是蜡块太大，以后取材的时候要注意取材的大小。要是蜡块组织太硬，可以放回水中浸泡，然后再重新脱水和包埋。 石蜡切片 看着还不错

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