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琼脂糖凝胶电泳的实验原理及步骤
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在分子生物学实验中，琼脂糖凝胶电泳是一项基础的技术， DNA 片段的分离、鉴定， PCR 产物的检测、质粒的提取验证，都离不开它。很多新手第一次接触时并不清楚原理，今天这篇文章，就从原理到实操，带你解析脂糖凝胶电泳。01琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖（Agarose）是从红藻（如石花菜、江蓠等）中提取的一种天然多糖，琼脂糖是一种线性多糖分子，当它被加热溶解在如电泳缓冲液中时，分子会均匀分散；待温度冷却至 30-40℃时，这些线性分子会通过氢键相互连接，形成三维网状结构 —— 也就是我们实验中用到的 “琼脂糖凝胶”。①凝胶是核酸分子的分离通道凝胶中的孔洞是核酸分子移动的通道，核酸分子需要穿过这些孔洞才能向正极移动；孔洞的大小可以通过调整琼脂糖的浓度来控制：浓度越高，分子连接越密集，孔洞越小；浓度越低，分子连接越疏松，孔洞越大。比如分离 50-500bp 的小分子 DNA 时，用 2% 的琼脂糖凝胶（小孔洞）能让小分子精准分离；而分离 1000bp 以上的大分子 DNA 时，用1% 的琼脂糖凝胶（大孔洞）能避免大分子被 “卡住”，保证分离效率。 ②电场是推动核酸分子移动的动力核酸分子（DNA、RNA）本身带有负电荷（因磷酸基团解离），在电场中会向带正电荷的 “正极” 移动。实验时，我们会将凝胶放入电泳缓冲液中，接通电源后，凝胶两端形成稳定电场，核酸分子就会沿着电场方向移动。③按分子量大小 分离核酸分子在凝胶中移动时，会受到凝胶孔洞的 “阻力”—— 分子量越小的核酸分子，体积越小，越容易穿过凝胶孔洞，移动速度越快；分子量越大的分子，受到的阻力越大，移动速度越慢。经过一段时间电泳后，不同分子量的核酸分子会在凝胶中形成 “条带”：小分子条带靠近正极，大分子条带靠近负极，通过与已知分子量的 “DNA Marker”（标准参照物）对比，就能快速判断未知核酸片段的大小。 02琼脂糖凝胶的配置1.称取琼脂糖：按所需浓度计算琼脂糖粉末用量。如：配制 100mL 1% 琼脂糖凝胶，需称取 1g 琼脂糖粉末。2.溶解琼脂糖：将称好的琼脂糖粉末放入锥形瓶中，加入 50mL TAE 缓冲液，轻轻摇匀后，放入微波炉中加热（中高火，每次加热 30 秒，取出摇匀，重复 2-3 次），直到琼脂糖粉末完全溶解，溶液呈透明无颗粒状（注意：加热时锥形瓶需敞口，避免溶液沸腾溢出，取出时要戴手套防烫伤）；3.加入核酸染料：加入适量的核酸染料，如 100mL 溶液加 10μL染料，具体浓度按染料说明书调整，轻轻颠倒锥形瓶混匀（避免产生气泡）；4.倒胶与插梳：将电泳槽的胶托洗净擦干，放入水平台；将混匀的琼脂糖溶液缓慢倒入胶托中，避免产生气泡；然后将梳子垂直插入凝胶一端的凹槽中（梳子齿间距根据样品数量选择），静置 30-40 分钟，待凝胶完全凝固即可使用。使用的时候轻轻将梳子拔出。03跑胶1.准备样品：在离心管中按比例混合待检测样品与上样缓冲液（常用 6× 上样缓冲液，体积比为样品：上样缓冲液 = 5:1，如 5μL 样品加 1μL 上样缓冲液），轻轻混匀（上样缓冲液含指示剂，可指示电泳进度，还能增加样品密度，让样品沉入梳孔底部）；2.加样：用移液器吸取混合好的样品（如 6μL / 孔），将枪头缓慢伸入梳孔上方，缓慢推注样品，避免枪头触碰凝胶导致梳孔损坏，也避免样品溢出到相邻梳孔（每加完一个样品，更换一次枪头，防止交叉污染）；3.加 Marker：在其中一个梳孔中加入 5-10μL DNA Marker（作为分子量参照），方便后续判断样品片段大小，一般加在第一个孔中。04电泳1.连接电源：将电泳槽的电极线与电源连接，确保 “凝胶负极” 接电源负极，“凝胶正极” 接电源正极（接反会导致核酸向相反方向移动，样品无法进入凝胶）；2.设定参数：调整电压与时间 —— 常规分离可设电压为 80-120V，时间为 20-40 分钟（电压过高会导致凝胶发热，样品条带模糊；电压过低则电泳速度慢，分离效率低）；可通过上样缓冲液中的指示剂（如溴酚蓝）判断电泳进度：溴酚蓝移动到凝胶中间或 2/3 处时，即可停止电泳。05照胶取出凝胶，将凝胶放入凝胶成像仪中，选择对应的激发光（如紫外光，EB 染料需用紫外光激发，且操作时需戴紫外防护手套，避免紫外线伤害），启动成像仪，调整曝光时间，直到条带清晰可见；06结果分析通过成像图观察，若出现清晰的条带，对比 Marker 的条带位置，可确定样品的分子量大小；DNA Marker/Ladder 由特定分子量的双链DNA 片段组成，已混有含蓝色染料的上样缓冲液，适用于琼脂糖凝胶电泳时作为DNA 分子量标准。DNA Marker/Ladder 中所有片段均由质粒经酶切、纯化后获得。 |
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