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科研一把抓

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MS 与 HPLC-FLD 双平台检测全攻略

【硬核科普 · 1 g 样品打通三大代谢通路】
—— 维生素 B₆（吡哆醇/醛/胺）LC-MS/MS 与 HPLC-FLD 双平台检测全攻略 ——

📸 先上结论
称样 1–5 g → 酸解+酶解 → 固相净化 → LC-MS/MS 8 min 或 HPLC-FLD 15 min
检出限 0.5 µg/100 g，RSD＜4 %；
一次进样，同时量化 3 种形态，打通“蛋白质+神经递质+免疫”三重健康开关！

🧪 方法 5 步曲
1️⃣ 提取：0.1 M HCl 100 ℃ 30 min，释放结合型 B₆
2️⃣ 酶解：酸性磷酸酶+磷酸二酯酶 37 ℃ 过夜，拆掉磷酸“锁”
3️⃣ 衍生（仅 FLD 法）：Na₂SO₃ 还原，吡哆醛→吡哆醇，统一形态
4️⃣ 净化：HLB 固相萃取，去色素、去脂、去盐
5️⃣ 分离检测
• LC-MS/MS：C18 柱，甲醇-0.1 % 甲酸水梯度，MRM 模式
   离子对：m/z 170→152（吡哆醇）、m/z 168→134（吡哆醛）、m/z 169→151（吡哆胺）
• HPLC-FLD：激发 293 nm，发射 395 nm，柱后衍生统一测“总 B₆”

📊 一张色谱图 = 四重身份
🌾 全麦粉：总 B₆ 0.45 mg/100 g，其中吡哆醇占 70 %→越精制损失越大
🥛 调制乳粉：强化后 0.8 mg/100 g，GB 14880 要求 0.4–2.0 mg，以吡哆醇计
🍞 即食谷物：宣称“高 B₆”，实测≥0.5 mg/100 g 才合规
🐈 宠粮：猫日需 0.4 mg/1000 kcal，缺 4 周出现“抽搐、贫血”，犬可合成一半

⚖️ LC-MS/MS vs HPLC-FLD vs 微生物法
• LC-MS/MS：8 min 三形态同步定量，灵敏度 0.5 µg/100 g，适合基料复杂样品
• HPLC-FLD：15 min 测“总 B₆”，成本低，工厂 QC 首选
• 微生物法：特异性高，但 72 h 出数，只给“总活性”，无法区分形态

🛠️ 实验避坑 9 连
⚠️ 光热分解：吡哆醛 25 ℃ 光照 2 h 损失 20 %，全程棕色瓶+铝箔+冰盒
⚠️ 磷酸化锁死：未酶解直接上机，结果偏低 30 %，磷酸酶活力≥5 U/mg 不可省
⚠️ 吡哆醛氧化：pH＞8 室温 30 min 生成 4-吡哆酸，LC-MS 会出现 m/z 184 干扰峰，体系维持 pH 4–5
⚠️ 基质抑制：高盐乳粉，MRM 信号↓50 %，用 ²H₃-吡哆醇内标校正回收率
⚠️ 柱温漂移：30→35 ℃，吡哆醇保留时间前移 0.3 min，柱温箱锁定 30 ℃ ±0.5 ℃
⚠️ 衍生残留（FLD）：亚硫酸钠过量，基线抬高，柱后泵速 0.2 mL/min 精准控制
⚠️ 脂质包裹：鲜肉/肝脏，乙腈沉淀蛋白后取上清，再过 HLB 柱，防峰拖尾
⚠️ 甲醇试剂：色谱纯新开瓶，旧瓶含甲酸，吡哆胺峰形前裂
⚠️ 宠粮喷脂：脂肪包被 B₆，粉碎后先冷冻脱脂（-20 ℃ 30 min）再提取

🌈 小课堂 · 3 个冷知识
1. 吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺在体内可互转，但生物活性依次降 1→0.8→0.6，因此国标以“吡哆醇当量”计总 B₆。
2. 猫缺乏 B₆ 4 周，出现小红细胞性贫血，犬需 8 周；猫粮必须外给足量。
3. 烘焙 200 ℃ 15 min 吡哆醛损失 40 %，吡哆醇仅 10 %，所以强化多用盐酸吡哆醇。

📌 结论
1 g 样品、一根色谱柱、三重四极杆一扫描，就能把“三兄弟”同时量化。
数据背后：
• 一粒全麦的 B₆ 形态谱，决定蛋白质代谢效率
• 一段奶粉强化量，关乎婴儿夜间惊厥阈值
• 一袋宠粮标签值，决定猫咪会不会“抽搐+贫血”
记住：B₆ 有三种，活性各不同；
LC-MS/MS 不是“测维生素”，是给食品做“代谢通路体检”！

#维生素B6 #吡哆醇 #吡哆醛 #吡哆胺 #LCMSMS #HPLC荧光 #GB5009_154 #宠物营养 #免疫代谢

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1楼2025-10-26 15:11:39

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