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毕合生物2024

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专业: 微生物资源与分类学

[交流] 导致蛋白质沉淀/聚集的关键因素已有2人参与

物理因素：蛋白质的天敌 ️

最常见的物理因素！温度绝对是头号杀手记得我上个月辛辛苦苦纯化的IL-2蛋白吗？放在实验室台面上忘记及时放回4℃冰箱，两小时后回来就看到溶液变得浑浊，简直想哭高温会增加蛋白分子的动能，促使其暴露内部疏水基团，进而形成无规则聚集体。

还有一个反复伤害我的就是冻融循环上上周取样分析，一支珍贵的抗体反复从-80℃拿出来又放回去，到第三次时已经出现了明显的微粒。冻融过程中形成的冰晶会对蛋白质结构造成机械损伤，每冻一次，损伤就累积一分！

另外大家别忘了剪切力的影响！我曾经为了快速溶解一支浓缩蛋白，用力摇晃、甚至用漩涡混匀器高速震荡，结果产生大量泡沫，回头一看，蛋白活性只剩原来的30%了这是因为剪切力和气-液界面会导致蛋白质展开变性。

最后是浓度过高的问题，有次为了提高产量，我将重组GPCRs蛋白浓缩到8mg/ml，结果第二天来一看，全变成了果冻状高浓度时蛋白分子间相互作用的机会大大增加，特别是对于那些表面疏水区域多的蛋白！

化学因素：细微变化，巨大影响

pH值变化简直是蛋白质的噩梦！记得有一次我的缓冲液配错了，pH偏离了最佳值1.5个单位，我的激酶蛋白立刻就出现了絮状沉淀因为pH会改变蛋白表面电荷分布，影响其溶解度和构象稳定性。

离子强度波动也是个隐形杀手曾经我按照文献将纯化好的蛋白透析到低盐缓冲液中，想着"低盐肯定好啊"，结果第二天一看，全部沉底了！某些蛋白需要一定的盐浓度来屏蔽表面电荷，维持溶解状态。

错误的缓冲液组分也是灾难源头去年我用Tris缓冲液保存一个含有大量赖氨酸残基的蛋白，两天后发现大量沉淀——原来Tris会与这些赖氨酸残基发生反应。后来改用PBS，问题立刻解决！

还有氧化还原环境变化一个含有多个半胱氨酸的转录因子，我没有及时加入DTT，让它暴露在空气中过夜，第二天发现形成了大量二硫键交联的聚合物。

生物因素：蛋白自身的"性格"问题

有些蛋白天生就有"社交恐惧症"，比如我研究的一种膜蛋白，无论怎么优化条件，离开了脂质环境就开始聚集这完全是由于其高度疏水的跨膜区域决定的。

翻译后修饰缺失也是常见原因。有次我们在大肠杆菌中表达一个需要糖基化的人源蛋白，纯化后总是形成包涵体，后来才发现没有正确的糖基化修饰，蛋白就无法保持正确折叠。

最可怕的是蛋白酶污染！上个季度我有一支蛋白样品被微量蛋白酶污染，过夜后不但沉淀，还失去了全部活性那些被部分降解的片段往往会暴露出原本隐藏的疏水区域，引发大规模聚集。

操作因素：人为失误最心痛

纯化过程中的错误操作简直是家常便饭...记得我有次急着下班，忘记调整洗脱缓冲液的pH，结果第二天的样品全部混浊。另一次是我急于得到结果，将蛋白从凝胶过滤柱上快速洗脱，结果造成局部高剪切力，导致蛋白大量失活沉淀。

储存条件不当也是大忌！我最心痛的一次是将价值不菲的抗体放在实验室窗台边，被阳光直射了整个下午，回来时已经变成了一堆"豆腐渣" 紫外线导致蛋白质内部氨基酸残基光氧化，破坏了整体结构。

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