| 查看: 962 | 回复: 2 | |||
[交流]
导致蛋白质沉淀/聚集的关键因素 已有2人参与
|
|
物理因素：蛋白质的天敌 ️ 最常见的物理因素！温度绝对是头号杀手记得我上个月辛辛苦苦纯化的IL-2蛋白吗？放在实验室台面上忘记及时放回4℃冰箱，两小时后回来就看到溶液变得浑浊，简直想哭 高温会增加蛋白分子的动能，促使其暴露内部疏水基团，进而形成无规则聚集体。 还有一个反复伤害我的就是冻融循环上上周取样分析，一支珍贵的抗体反复从-80℃拿出来又放回去，到第三次时已经出现了明显的微粒。冻融过程中形成的冰晶会对蛋白质结构造成机械损伤，每冻一次，损伤就累积一分！ 另外大家别忘了剪切力的影响！我曾经为了快速溶解一支浓缩蛋白，用力摇晃、甚至用漩涡混匀器高速震荡，结果产生大量泡沫，回头一看，蛋白活性只剩原来的30%了 这是因为剪切力和气-液界面会导致蛋白质展开变性。 最后是浓度过高的问题，有次为了提高产量，我将重组GPCRs蛋白浓缩到8mg/ml，结果第二天来一看，全变成了果冻状 高浓度时蛋白分子间相互作用的机会大大增加，特别是对于那些表面疏水区域多的蛋白！ 化学因素：细微变化，巨大影响 pH值变化简直是蛋白质的噩梦！记得有一次我的缓冲液配错了，pH偏离了最佳值1.5个单位，我的激酶蛋白立刻就出现了絮状沉淀因为pH会改变蛋白表面电荷分布，影响其溶解度和构象稳定性。 离子强度波动也是个隐形杀手 曾经我按照文献将纯化好的蛋白透析到低盐缓冲液中，想着"低盐肯定好啊"，结果第二天一看，全部沉底了！某些蛋白需要一定的盐浓度来屏蔽表面电荷，维持溶解状态。 错误的缓冲液组分也是灾难源头 去年我用Tris缓冲液保存一个含有大量赖氨酸残基的蛋白，两天后发现大量沉淀——原来Tris会与这些赖氨酸残基发生反应。后来改用PBS，问题立刻解决！ 还有氧化还原环境变化 一个含有多个半胱氨酸的转录因子，我没有及时加入DTT，让它暴露在空气中过夜，第二天发现形成了大量二硫键交联的聚合物。 生物因素：蛋白自身的"性格"问题 有些蛋白天生就有"社交恐惧症"，比如我研究的一种膜蛋白，无论怎么优化条件，离开了脂质环境就开始聚集 这完全是由于其高度疏水的跨膜区域决定的。 翻译后修饰缺失也是常见原因。有次我们在大肠杆菌中表达一个需要糖基化的人源蛋白，纯化后总是形成包涵体，后来才发现没有正确的糖基化修饰，蛋白就无法保持正确折叠。 最可怕的是蛋白酶污染！上个季度我有一支蛋白样品被微量蛋白酶污染，过夜后不但沉淀，还失去了全部活性 那些被部分降解的片段往往会暴露出原本隐藏的疏水区域，引发大规模聚集。 操作因素：人为失误最心痛 纯化过程中的错误操作简直是家常便饭...记得我有次急着下班，忘记调整洗脱缓冲液的pH，结果第二天的样品全部混浊。另一次是我急于得到结果，将蛋白从凝胶过滤柱上快速洗脱，结果造成局部高剪切力，导致蛋白大量失活沉淀。 储存条件不当也是大忌！我最心痛的一次是将价值不菲的抗体放在实验室窗台边，被阳光直射了整个下午，回来时已经变成了一堆"豆腐渣" 紫外线导致蛋白质内部氨基酸残基光氧化，破坏了整体结构。 毕合生物(www.bihebio.com)提供服务内容：分子生物学、免疫, 重组蛋白及ELISA相关、活性小分子化合物、高端化学、材料化学、细胞资源库与培养相关、生命科学、天然产物 |
回复此楼» 猜你喜欢
售T0P一区SCI文章，我:8O5.51.O.54,科目齐全,可＋急
已经有6人回复
-
售T0P一区SCI文章，我:8O5.51.O.54,科目齐全,可＋急
已经有9人回复
-
售T0P一区SCI文章，我:8O5.51.O.54,科目齐全,可＋急
已经有9人回复
-
售T0P一区SCI文章，我:8O5.51.O.54,科目齐全,可＋急
已经有9人回复
-
售T0P一区SCI文章，我:8O5.51.O.54,科目齐全,可＋急
已经有7人回复
-
售T0P一区SCI文章，我:8O5.51.O.54,科目齐全,可＋急
已经有7人回复
-
第三年，祈求好运！
已经有5人回复
-
售T0P一区SCI文章，我:8O5.51.O.54,科目齐全,可＋急
已经有10人回复
-
售T0P一区SCI文章，我:8O5.51.O.54,科目齐全,可＋急
已经有5人回复
-
售T0P一区SCI文章，我:8O5.51.O.54,科目齐全,可＋急
已经有4人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
滴滴Grace合肽库
木虫 (著名写手)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 1990.7
- 散金: 289
- 沙发: 2
- 帖子: 1054
- 在线: 96.7小时
- 虫号: 23321770
- 注册: 2020-08-05
- 性别: MM
- 专业: 肿瘤学
2楼2025-10-27 09:05:58
| 感谢分享 |
3楼2025-10-27 14:31:43
170