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科研战神来了

新虫 (小有名气)

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[交流] 实验技术干货 | Transwell 操作标准化流程及避坑指南

一、实验原理Transwell 实验的核心在于通过多孔膜装置模拟体内细胞穿越组织屏障的生理过程，常用于研究细胞迁移、趋化性和侵袭能力。其原理关键要点如下：

•装置构成：由 Transwell 小室（含渗透膜）和孔板组成，膜上小孔直径通常为 0.1 - 12μm（根据细胞类型选择，如肿瘤细胞侵袭实验常用 8μm 孔径）。
•细胞运动逻辑：上室接种细胞，下室放置化学引诱剂（如 FBS、生长因子）形成浓度梯度，细胞感知刺激后通过伪足伸展、细胞骨架重构等方式穿过膜孔迁移至下室。
•生理意义：迁移实验可研究细胞在无基质胶情况下的迁移能力（如炎症细胞向趋化因子的移动）；侵袭实验则在膜上预铺基质胶（模拟细胞外基质），评估细胞突破屏障的能力（如肿瘤细胞侵袭转移）。

二、实验 Tips
实验准备环节：桌面用 75% 酒精擦拭，器材提前灭菌（如小室、枪头），避免污染影响细胞活性；
固定染色环节：多聚甲醛固定前先洗去培养基残留，结晶紫染色后可不洗直接擦细胞，减少杂质干扰；
棉签操作环节：擦拭上室细胞时力度轻柔，沿一个方向擦拭（避免来回摩擦导致膜孔堵塞），防止破坏膜结构；
拍照记录环节：务必拍到膜孔结构，标注放大倍数和视野位置，增强结果真实性。

三、常见问题解决

迁移细胞过少：可能因细胞浓度过低、趋化因子浓度不足或培养时间过短，需优化浓度梯度和时间；

背景染色深：多聚甲醛固定后清洗不彻底，或结晶紫染色时间过长，需缩短染色时间并充分洗去多余染料。

四、 Transwell 小室操作

1. 细胞悬液制备
消化细胞后，无血清培养基洗 3 次（去除血清中的生长因子干扰），计数后配置成 2×10⁵/ml 悬液（首次实验需摸索最佳细胞浓度，如 2 - 5×10⁴细胞 / 小室）。

2. 上室与下室接种
上室加入 100μl 细胞悬液（含 2×10⁴细胞），下室加入 600μl 含 20% FBS 的完全培养基（FBS 作为趋化因子诱导迁移）。
⚠ 关键细节：上室加样时避免气泡，下室液体需覆盖膜底部，确保浓度梯度有效形成。

五、培养与染色
1. 孵育与固定染色
37℃、5% CO₂ 孵育 48 小时（首次实验需测试 24 - 72 小时不同时间点，观察迁移效率）。取出小室，PBS 洗 2 次，4% 多聚甲醛固定 30 分钟，结晶紫（无需稀释）染色 30 分钟，再用 PBS 洗 2 次。
✅操作技巧：用棉签轻擦上室未迁移细胞时，小室内保留少量 PBS，避免膜干燥或破损。
2. 拍照与观察
将小室置于载玻片上，倒置显微镜下用 10× 或 20× 物镜拍照，按从左到右顺序采集多个视野（如每孔拍 5 个视野），确保覆盖膜的不同区域。

六、小室清洗
清洗流程
ddH₂O 浸泡 24 小时，75% 酒精浸泡消毒，紫外线照射 30 分钟，晾干后密封保存（适用于可重复使用的小室）。

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1楼 2025-10-22 16:10:54

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