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CRISPR敲除细胞系构建指南：实现高效基因编辑的全流程解析
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CRISPR/Cas9 技术因其高效、灵活且可编程的特性，已成为探索基因功能、疾病机制及药物靶点验证的重要基因编辑工具。与瞬时编辑不同，稳定敲除细胞系（Stable Knockout Cell Line） 能在多代传代中维持一致的基因缺失状态，从而显著提升实验结果的重复性与可靠性，是生命科学研究与新药开发中至关重要的实验模型。 然而，稳定敲除细胞系的建立并非单一实验，而是一个涵盖sgRNA 设计、载体构建、转染筛选与单克隆验证等多个环节的系统化流程。本文将以实践为导向，系统梳理利用 CRISPR/Cas9 构建稳定敲除细胞系的标准步骤，并介绍如何借助专业的基因编辑服务平台，实现更精准、更高效的细胞系构建。 一、实验前准备 在正式开展 CRISPR/Cas9 基因敲除实验前，需要对目标基因与所用细胞进行系统评估，以确保后续操作的有效性与可行性。准备阶段主要包含以下几个方面： 目标基因确认：对目标基因的转录本、可变剪接形式以及关键功能结构域进行全面分析，可参考 Ensembl、NCBI 等主流基因数据库，以确保选取的靶点区域具备代表性和功能相关性。 细胞特性评估：深入了解实验细胞的基础特性，包括转染效率、增殖速度、药物敏感性及培养稳定性；对于原代细胞、干细胞或免疫细胞等难转染类型，需考虑使用更高效的递送系统或优化条件。 基因编辑可行性判断：结合公开资源（如 DepMap、Gene Essentiality 数据库）或利用专业的基因依赖性评估工具，提前预测目标基因是否为细胞生存必需基因，避免因敲除引起细胞死亡或生长受限等问题。 验证方案设计：在实验初期即规划好后续验证流程，如蛋白表达检测（Western Blot）、mRNA 水平分析（qPCR）、功能性实验以及一代测序（Sanger Sequencing）等，以保证敲除效果得到多层面验证。 图一：敲除细胞系构建流程 二、实验步骤 1. sgRNA 与基因型鉴定引物（Genotyping Primer）的设计与合成 （1） sgRNA 设计：通过分析目标基因序列，选择合适的靶点。建议优先选择靶向关键功能结构域外显子的 sgRNA，以实现更彻底的基因失活。设计时应综合考虑以下因素 l On-target 编辑效率评分 l 潜在脱靶效应（可使用 CRISPOR、Benchling 、红棉CRISPR基因编辑系统等工具） l 外显子位置、阅读框影响及 PAM 序列可及性 （2） 引物设计：根据 sgRNA 靶点上下游序列设计 PCR 引物，扩增长度建议控制在 250–800 bp 之间，以便后续突变检测（T7E1 断裂实验或 Sanger 测序）。 2. 载体构建 将设计好的 sgRNA 序列克隆至同时表达 Cas9 蛋白及筛选标记（如嘌呤霉素抗性基因或 EGFP）的质粒载体中，是 CRISPR/Cas9 编辑体系建立的关键环节。优化的载体骨架有助于提升 sgRNA 的表达水平和 Cas9 的切割活性，尤其在处理难转染细胞或开展多靶点联合敲除实验时尤为重要。此类构建策略已被广泛应用于肿瘤研究、神经生物学、代谢疾病及细胞治疗等领域，为复杂生物学问题提供了高效的基因操作平台。 3. 质粒验证 构建完成后，应通过测序对 sgRNA 插入片段进行验证，以确认序列的正确性和完整性。核实无碱基突变、无插入缺失以及方向正确，是确保后续基因编辑成功的质量控制关键步骤。严谨的质粒验证可有效避免假阴性或非特异性编辑等实验误差。 4. 质粒制备与质量检测 在进行细胞转染前，需要制备高纯度、无内毒素的质粒 DNA。常规检测包括测定 A260/A280 比值（理想范围为 1.8–2.0），并通过琼脂糖凝胶电泳评估质粒完整性。若样品中存在内毒素或杂质，不仅会降低转染效率，还可能影响细胞活性及生理状态，因此高质量质粒制备是成功编辑的重要保障。 5. 转染前优化 为了获得理想的基因编辑效率，转染前的细胞状态准备至关重要。建议确保细胞处于对数生长期、无支原体污染、细胞融合度保持在 70–90% 之间。同时，根据不同细胞类型选择最合适的转染方式，如化学转染、电穿孔或病毒介导转染等。良好的细胞状态与转染策略匹配，能够显著提高 Cas9 介导的切割效率与敲除成功率。 6. 细胞转染 将 CRISPR/Cas9-sgRNA 质粒导入细胞。设置适当对照：空载体阴性对照、阳性对照（编辑已知可见表型基因）、通过荧光或抗性筛选监测转染效率。 7. Cell Pool 筛选与鉴定 转染 48–72 小时后收集细胞群体（Cell Pool），提取基因组 DNA 进行突变检测。常用检测方法包括： l PCR + Sanger 测序：精确鉴定插入/缺失类型（indel） l T7E1 或 Surveyor 断裂实验：评估编辑效率与突变比例。 源井生物通过结合 PCR 检测与测序分析 的双重验证策略，对基因编辑效率进行精准评估。同时采用 并行筛选策略，快速锁定敲除效率最高的细胞群，大幅缩短单克隆筛选周期。其自主开发的 Genotype Analysis System 可实现测序结果的自动解析与数据分析，帮助研究者高效获取 Cell Pool 的基因敲除效率报告。 8. 单克隆细胞筛选与扩增 通过有限稀释法或流式分选（FACS）将细胞分配至单孔，实现单细胞克隆培养。扩增后提取基因组 DNA，再次进行突变检测，确认敲除类型（Homozygous/bi-allelic KO）。经验证的单克隆应进行功能验证，如蛋白表达丢失或信号通路变化，以确保真正实现基因敲除。 图二：源井生物基因型分析系统 9. 质量检测与冻存 稳定敲除细胞系建立后，应进行以下质量控制步骤 l 支原体检测：确保无污染 l STR 鉴定：验证细胞身份一致性 l 功能验证：检测靶基因表达及相关表型 通过质量检测的敲除细胞系应及时冻存（如使用含 10% DMSO 的 FBS 冻存液），以备后续使用。 三、源井生物敲除细胞系服务推荐 稳定敲除细胞系的构建流程复杂，对实验经验和细胞特性均有较高要求。源井生物（Ubigene） 提供从设计到交付的一站式基因敲除解决方案，助力科研人员高效构建高可靠性的模型系统其核心优势包括： lCRISPR-U™ 技术平台： 编辑效率提升 10–20 倍，复杂细胞成功率达 90% 以上 红棉 CRISPR基因编辑系统： 结合 AI 智能算法与1000+ 细胞参数数据库，实现高精度自动化设计与风险评估； 8000+ 标准化敲除细胞库： 覆盖多种细胞类型与研究方向，提供可直接使用的细胞模型； 全流程质控体系： 包括 STR 鉴定、支原体检测 和 功能验证，确保细胞的稳定性与一致性。 凭借累计 8000+ 成功项目经验，源井生物为全球科研机构和药企提供高质量敲除细胞系，显著缩短研发周期。 |
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