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免疫组化和免疫荧光（冰冻切片与石蜡切片）的区别
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免疫组化和免疫荧光都是本质都是基于 “抗原 - 抗体特异性结合” 的原理对组织或细胞中的特定抗原进行检测和定位的技术。01免疫组化的原理免疫组化基于抗原与抗体的特异性结合，再通过标记物的显色反应，将组织或细胞内的目标抗原 可视化，实现定位、定性和相对定量分析，这个过程通过直接在特异性抗体上连接显色标记物，如辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等，也就是我们所说的直接法，直接法虽然方法步骤简单，但是信号较弱。另外就是间接法，先使用未标记的特异性抗体（一抗）与抗原结合，再使用能识别一抗的 “二抗”，且二抗上连接了显色标记物。在间接法中，一个抗原可结合多个一抗，一个一抗又可结合多个二抗，相当于将初始信号放大，让最终显色更清晰，这也是目前更常用的方法。 02免疫荧光的原理免疫荧光则是基于抗原 - 抗体特异性结合与荧光标记技术的结合，通过荧光信号将组织或细胞内的目标抗原直可视化。同样也分直接法和间接法，直接法就是直接将将荧光素（如 FITC、Cy3）标记在特异性一抗上。一抗与抗原结合后，荧光素便直接标记目标抗原上。该方法步骤简单，但信号较弱，适用范围较窄。间接法则是先让未标记的一抗与抗原结合，再使用能识别一抗的 “二抗”，且二抗上预先标记了荧光素。由于一个一抗可结合多个二抗，能放大荧光信号，灵敏度更高，也是目前更常用的方法。 03冰冻切片和石蜡切片冰冻切片的制作过程：将预处理后的组织块放入包埋盒，加入 OCT 包埋剂。OCT 能固定组织形态，减少冰晶产生，并帮助组织与载物台贴合。将包埋好的组织放入冰冻切片机的冷冻室，设置温度为 -15℃至 - 25℃。不同组织冷冻温度不同，等到组织完全冷冻硬化，即可开始切片。石蜡切片的制作过程包括：1. 组织取材与固定2. 脱水与透明3. 浸蜡与包埋4. 切片与贴片，步骤相对于冰冻切片来说较为繁琐冰冻切片和石蜡切片的优缺点：冰冻切片能较好保留组织的抗原免疫活性，做免疫组化时无需进行抗原修复步骤。要是检测翻译后修饰，比如磷酸化，用冰冻切片会更有助于检测。缺点就是细胞里容易形成冰晶，破坏细胞结构，可能导致抗原扩散。石蜡切片能维持组织细胞的形态结构，能够在室温下保存。而冰冻切片就比较麻烦，必须存放在 - 80 度的低温冰箱里。由于石蜡切片能切到 4μm 左右的厚度，所以切出来的片子在颜色、形态上都比冰冻切片好。另外，我们在购买一抗的时候，产品应用说明会标注适用的切片类型。要是说明写着只能用于冰冻切片，那就不能用石蜡切片；要是写着两者都能用，那两种切片都可以用来做实验。04为什么冰冻切片不需要做抗原修复？冰冻切片对组织抗原影响小在冰冻切片制作时，组织主要经历快速冷冻和低温切片步骤。新鲜组织迅速被置于低温环境中冷冻，整个过程没有经历长时间的化学试剂处理和高温过程。所以使得组织内抗原的空间结构得以较好地保留，抗原决定簇没有被封闭或破坏，抗体能够直接与抗原结合 ，所以不需要进行抗原修复步骤，就可以直接进行免疫组化染色等后续操作。石蜡切片对组织抗原影响大而在石蜡切片制作过程中，组织需要经过固定（如福尔马林，甲醛固定）、脱水、透明和浸蜡等步骤。固定剂（如甲醛）会使蛋白质发生交联，形成醛键 ，从而封闭抗原决定簇，阻碍抗体与抗原的结合。此外在浸蜡和包埋步骤中，组织需要在相对较高的温度下进行处理，高温也可能会导致抗原的空间结构发生改变，进一步降低抗原的免疫活性。由于石蜡切片的制作过程对组织抗原造成了较大影响，使得大部分抗原决定簇被封闭或抗原结构发生变化，无法与抗体正常结合。因此，在进行免疫组化染色前，必须通过抗原修复的方法，如高温高压、酶消化等，打开交联的醛键，恢复抗原决定簇的空间结构，暴露抗原表位，这样才能使抗体与抗原顺利结合，完成后续的免疫组化检测。 |
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