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科研战神来了新虫 (小有名气)
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质粒转染的详细步骤
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细胞转染是指将外源核酸（如 DNA、RNA、siRNA 等）导入真核细胞内的技术，目的是让外源核酸在细胞中表达、复制或发挥特定功能（如基因编辑、基因沉默等）前几期内容中我们减少了瞬时转染与稳定转染以及不同细胞的转染效率差异等，今天我们介绍一下质粒转染的步骤，主要以赛默飞的lipo3000为例子。01 实验前准备 1.质粒 DNA（纯度高，A260/A280 比值 1.8-2.0左右）◦2.Lipofectamine 3000 试剂3.P3000™试剂（转染增强剂，与 Lipofectamine 3000 配套使用）4. Opti-MEM™ I 减血清培养基（用于稀释质粒和转染试剂）5.处于对数生长期的目标细胞（转染前 24 小时接种，确保转染时汇合度达 70%-90%）；6. 培养基02 具体实验步骤 一.细胞接种培养: 转染当天细胞汇合度控制在60%-80%较好二、转染操作步骤1. 制备 DNA - 转染试剂复合物稀释 DNA：取一无菌离心管A，加入 125μL Opti-MEM™培养基，加入 2.5μg 质粒 DNA，轻轻混匀后加入 5μL P3000™试剂，吹吸混匀（P3000 与 DNA 比例保持 1:0.5，确保结合效率）静置5min。稀释 Lipofectamine 3000：另取一离心管B，加入 125μL Opti-MEM™培养基，加入 5μL Lipofectamine 3000 试剂，轻轻混匀后室温静置 5 分钟。形成复合物：将 DNA-P3000 混合液缓慢加入 Lipofectamine 3000 稀释液中，轻轻混匀，室温静置 15 分钟。2. 细胞转染弃去6孔板原有培养基，每孔加入1.8mL培养基（不添加双抗），每孔缓慢加入 250μL复合物，轻轻晃动培养板使均匀分布，放回培养箱继续培养3. 后续处理转染后 4-6 小时：若细胞状态良好，可不必更换培养基；若出现轻微漂浮，更换为 2mL 新鲜完全培养基转染后 24-48 小时：检测转染效率（如荧光蛋白表达），48-72 小时检测目的基因表达。 |
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