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科研战神来了新虫 (小有名气)
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RNA浓度测定及反转录详细步骤
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| 前面我们介绍了RNA提取的步骤Trizol法提取RNA原理及详细实验步骤，提取得到的RNA使用DEPC水进行溶解后，用Nanodrop进行RNA浓度的检测。1Nanodrop检测RNA浓度的实验步骤 ①打开 Nanodrop 仪器电源，选择检测样本的类型②测试前先进行基座清洁：用移液器吸取2μl蒸馏水加到检测基座上，将样品臂放下，浸泡2-3分钟，用无尘纸将检测基座擦拭干净。③调零：清洁基座后，在下探头上加2μl DEPC（使用与样品对应的溶液，比如我们的RNA使用DEPC溶解的，就用DEPC 进行调零），放下探头（如果"Blank"右侧为"ON"：则自动调零，如是"OFF"，需要手动点击"Blank"按键），仪器就会以DEPC为空白对照，进行调零。 ④将加样表面和上探头的DEPC都用滤纸吸去，加入 1-2μl RNA 样品于加样表面上，放下上探头（如果"Measure"右侧为"ON"：，则自动测量，如是"OFF"，需手动点击"Measure"按键），仪器开始定量检测,得到浓度，A260/A280， A260/A230等信息，继续擦去RNA，滴加下一个样本。⑤检测完成后，点击结束实验，导出数据⑥测量结束后，吸去样品，加2μl蒸馏水，放下上探头，以清洁仪器表面。吸去蒸馏水，放下上探头。选择左上角菜单键弹出菜单，选择home回到主页。得到RNA浓度之后，就可以进行反转录步骤（根据反转录试剂盒确定反转录体系）：这里以赛默飞RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit两步法试剂盒为例子，不同实验室使用的试剂盒不同，根据说明书就可以了具体步骤：第一步进行RT 1：首先我们需要确定RNA和水的量，根据说明书合成第一链的步骤中模板 RNA（总 RNA） 的量在0.1 ng-5 µg中都可以，所以示例中我们就按照4μg的RNA量来计算：计算出所需RNA和水的体积，如下说明书12μL体系中1μL Oligo (dT)₁₈ primer和1μL random primer,剩余水加RNA=10μL所需RNA的体积=4000/RNA浓度；水的体积=10-RNA的体积之后可以将Oligo (dT)₁₈ 和random primer配成mix，记作RT1，比如这里有8个RNA需要进行反转录，那么RT1=10μ random+10 Oligo (dT)₁₈ ，一般会多配两个，也就是10个体系的量取出8联管，做好标记，依次加入水，RNA以及RT1 mix可选步骤：若 RNA 模板富含 GC 或存在二级结构，轻轻混匀后短暂离心，在 65°C 下孵育 5 分钟；随后置于冰上冷却，短暂离心，再将试管放回冰上。具体步骤：第一步进行RT 2：先配置RT2 mix:现在有10个样本需要进行反转录，将体系中所需的试剂量都×10，混合在一起配成RT2 mix，在8连管中添加8μL的RT2 mix孵育条件： 设置PCR仪程序：若使用 Oligo (dT)₁₈引物或基因特异性引物引发 cDNA 合成，在 42°C 下孵育 60 分钟；若使用随机六聚体引物引发合成，先在 25°C 下孵育 5 分钟，再在 42°C 下孵育 60 分钟。若 RNA 模板富含 GC，可将反应温度提高至 45°C。之后在 70°C 下加热 5 分钟终止反应。这样子就完成了RNA的反转录。 |
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