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纳米镍钛合金与钽涂层复合层的生物相容性研究
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引言 尽管医疗植入物材料的研发已有超过两百年的历史，但现有的植入物材料仍存在一定的生物相容性问题。植入物可能引发金属病、植入物排斥或血管组织纤维化等不良反应。此外，植入物金属部分与生物体液之间的直接接触可能会导致金属表面腐蚀，进而影响植入物的机械性能。 钛及其合金因其优异的耐腐蚀性和生物相容性而成为早期用于医疗植入物的主要金属之一。镍钛诺（NiTi）合金以其独特的超弹性和形状记忆效应著称，但由于含有较高比例的镍，其潜在的毒性限制了其在医学领域的应用。构建一种稳定且生物惰性的屏障层能够有效降低镍向体内释放的风险，并保护植入物免受损害。 实验 材料准备与表面处理 本研究选用的基体材料为镍钛合金 [NiTi (55.91wt% Ni - 44.03wt% Ti)]，该合金具有良好的生物相容性和机械性能。为了制备表面复合层，选择了化学纯的钛（Ti）和钽（Ta）作为涂层材料。所有材料在使用前均需经过严格的预处理，包括机械打磨、超声波清洗（使用乙醇和去离子水）、以及最终的干燥处理，以确保表面清洁无杂质。 化学气相沉积（CVI）复合材料的制备 采用化学气相沉积（CVI）技术。沉积过程在一个高真空环境下进行，使用 AINSTAMTC 公司的设备，在氩气（Ar）气氛中操作。首先，将处理后的镍钛合金基体固定在沉积室内，并进行预处理，即离子蚀刻，以去除表面氧化层并增加表面活性。该步骤包括表面清洗、活化以及氩离子轰击抛光，确保沉积表面具有良好的洁净度和粗糙度。然后对原件进行原子沉积处理。 活性氧（ROS）生成的评估 为了评估复合材料在模拟生理条件下对 ROS 生成的影响，我们设计了一套化学发光检测系统。将样品浸入 pH 为 6.8 的过氧化氢磷酸盐缓冲液中，并加热至 37°C，持续 200 分钟。通过鲁米诺 - p 碘酚 - 过氧化物酶体系测量过氧化氢的生成情况。另外，使用香豆素 3 羧酸（Coumarin 3 - carboxylic acid）作为羟基自由基的荧光探针，在 80°C 下加热 2 小时的 20 mM 磷酸缓冲溶液（pH 6.8）中检测羟基自由基的浓度变化。 细胞培养与生物相容性测试 细胞培养 本研究选取了两种细胞系作为模型：人外周血管肌成纤维细胞和人骨髓间充质干细胞（MSC）。肌成纤维细胞通过切断周围静脉的方式获取，并在添加了 10% 胎牛血清（FBS）和 40 μg/mL 庆大霉素的 DMEM 培养基中维持生长，培养条件为 37°C 和 5% CO₂。MSC 则在相同的培养条件下使用 α - MEM 培养基（含 10% FBS）进行培养。 生物相容性测试 将制备好的材料样品（尺寸 25×25 mm）放置于六孔板中，每孔一个样品。接着，将细胞以每平方厘米 25×10³ 个细胞的密度接种到样品表面，并在适宜的培养条件下培养 5 天。在此期间，定期更换培养基以保持营养供应。为了评估细胞的存活状态，使用荧光染料吖啶橙（1 μg/mL）和碘化丙啶（1 μg/mL）对细胞进行染色。吖啶橙能够染色活细胞的核，而碘化丙啶只能进入死亡细胞的核内。染色后，样品在 37°C 下孵育 10 分钟，并在 DM 6000 荧光显微镜下观察和计数。此外，为了进一步评估细胞的增殖能力，我们在接种后第三天使用 Hoechst 33342 染料（10 μg/mL）对细胞核进行染色，并通过荧光显微镜观察处于有丝分裂各个时期的细胞数量。细胞周期各阶段的判定基于染色质的分布特征。 形态学分析 在培养结束时，对生长在不同材料表面的细胞进行形态学分析。使用扫描电子显微镜（SEM）观察细胞的附着情况和铺展形态。SEM 图像有助于了解细胞与材料表面之间的相互作用以及细胞的生长状态。 结果 ROS 生成的抑制 研究表明，钽涂层在降低活性氧物种（ROS）生成方面表现尤为出色，与未涂层的镍钛合金相比，钽层能减少约 60% 的过氧化氢浓度，而钛层则减少约 40%。此外，通过使用羟基自由基特异性荧光探针（如香豆素 3 羧酸），发现钽和钛涂层分别能使羟基自由基的形成减少约 80% 和 70%。 生物相容性评价 为了全面评估纳米结构镍钛合金及其复合材料的生物相容性，本研究采用了两种不同来源的人体细胞 —— 人外周血管肌成纤维细胞和人骨髓间充质干细胞（MSC），作为细胞模型。这两种细胞类型在组织修复过程中扮演着关键角色，它们的健康状态直接影响着植入物在体内的长期稳定性和功能。 细胞存活率 在实验过程中，我们通过荧光染料吖啶橙和碘化丙啶对细胞进行了标记，以区分活细胞和死细胞。实验结果表明，在镍钛基体（NiTi）、钽涂层镍钛（Ta@NiTi）以及钛涂层镍钛（Ti@NiTi）三种材料上，细胞存活率均非常高。具体而言，在肌成纤维细胞中，三种材料的存活率分别为 91 ± 3%、95 ± 2% 和 97 ± 2%；而在 MSC 中，则分别为 95 ± 1%、96 ± 3% 和 96 ± 2%。这些数据表明，无论是原始的镍钛合金还是经过钽或钛涂层处理的复合材料，均未表现出对细胞生长的急性毒性。 细胞增殖 进一步地，我们利用 Hoechst 33342 荧光染料对有丝分裂细胞进行了定量分析，以评估细胞的增殖能力。结果显示，在 Ta@NiTi 表面上，肌成纤维细胞和 MSC 的有丝分裂指数分别达到了 6.1% 和 4.3%，远高于 NiTi（3.1% 和 1.8%）以及 Ti@NiTi（5.8% 和 4.7%）。这表明钽涂层不仅能促进细胞的生存，还能显著增强细胞的增殖活动。 细胞形态 除了定量分析外，我们还对细胞形态进行了定性观察。经过五天的培养后，观察到在 Ta@NiTi 和 Ti@NiTi 表面上，肌成纤维细胞与 MSC 形成了更加致密且连续的单层细胞，显示出良好的细胞铺展和细胞间相互作用。相比之下，在 NiTi 表面上，虽然细胞存活情况良好，但细胞的铺展度较低，且未完全形成单层。 结论 本研究通过对纳米结构镍钛合金 [NiTi (55.91wt% Ni - 44.03wt% Ti)] 表面采用化学气相沉积（CVI）技术形成的钽（Ta@NiTi）或钛（Ti@NiTi）复合层进行了深入探讨，揭示了这些复合材料在生物相容性方面的优越表现。钽涂层不仅有效抑制了活性氧（ROS）的生成，减少了镍离子的释放，而且极大地促进了细胞的附着、增殖以及形态发育，这为开发新一代高性能生物医用材料提供了理论依据和技术支持。此外，钽涂层在减少 ROS 生成的同时，还能显著提升细胞的存活率和有丝分裂指数，表明其作为生物医用材料涂层的优越性能。尽管如此，还需要进一步的研究来验证这些材料在复杂生理环境中的长期稳定性和安全性，以及在不同临床应用中的实际效果。未来的研究方向将包括探索不同厚度和成分的钽涂层对生物相容性的影响，并进行更为广泛的动物实验和临床前试验，以确保这些材料在实际应用中的安全性和有效性。 |
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