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分子克隆基础篇4：筛选
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01分子克隆过程中的筛选将重组的质粒转导至感受态细胞中，根据相应的抗性筛选阳性质粒筛选的步骤：a.将质粒转导合适的感受态细胞中b.选择与重组质粒上对应抗性基因原核筛选药物，平板上筛选长出阳性克隆的阳性菌 02什么是感受态细胞感受态细胞是指经过特殊处理（如化学诱导、电穿孔等）后，细胞膜通透性改变，能够吸收外界环境中 DNA 分子（如质粒、重组载体）的宿主细胞（最常用的是大肠杆菌）感受态细胞的制备方法：化学法：最常用钙离子（Ca²⁺）处理。在低温下，细胞处于 0℃的 CaCl₂低渗溶液中，钙离子会使细胞膜结构发生变化，形成 “感受态小泡”，同时降低 DNA 的负电荷，便于其黏附在细胞膜表面；后续通过短暂高温（如 42℃热休克）刺激，细胞膜通透性瞬间增大，外源 DNA 得以进入细胞。物理法：如电穿孔法，通过高压脉冲电场在细胞膜上形成瞬时微孔，让 DNA 通过微孔进入细胞，效率通常高于化学法。03转化的步骤1.感受态细胞解冻:从 - 80℃冰箱取出感受态细胞,迅速放在冰上解冻（约 5~10 分钟），避免室温放置导致细胞失活。 2. 加入外源 DNA:待细胞完全解冻后，取50μL加入 1~5μL 重组质粒 DNA，轻轻混匀冰浴静置 20分钟，让 DNA 充分吸附在细胞表面。 3. 热休克处理：将离心管快速转移到 42℃水浴中，放置60S（不同菌株时间可能略有差异），此步骤通过温度骤变使细胞膜通透性瞬间增大，促进 DNA 进入细胞。 4. 冰浴复苏：热休克后立即将离心管放回冰上，静置 2~3 分钟，让细胞膜恢复正常结构，稳定细胞状态。 5. 添加培养基培养：向离心管中加入500μL 无菌 LB 液体培养基（不含抗生素），37℃、200rpm 振荡培养 45~60 分钟，让细胞复苏并表达载体上的抗性基因。 6. 涂布平板筛选：3000rpm离心5min，去除上清液，留下100μL左右重悬菌沉淀，均匀涂布在含对应抗生素的 LB 固体培养基上，倒置平板，37℃培养箱中培养 12~16 小时，直至长出单菌落。 7. 后续筛选挑取单菌落进行后续鉴定，确认阳性克隆。04常用原核筛选抗生素的分类及作用机制 ①β- 内酰胺类（如氨苄青霉素、羧苄青霉素） 作用机制：抑制细菌细胞壁合成。 抗性基因原理：质粒携带AmpR基因，编码 β- 内酰胺酶，可水解抗生素的 β- 内酰胺环，使其失活。 ②氨基糖苷类（如卡那霉素、新霉素）作用机制：干扰细菌核糖体功能，抑制蛋白质合成。 抗性基因原理：质粒携带kanR基因，编码氨基糖苷磷酸转移酶，通过磷酸化修饰抗生素使其失去活性。 ③氯霉素作用机制：结合细菌核糖体 50S 亚基，抑制蛋白质合成。抗性基因原理：质粒携带CAT基因，编码氯霉素乙酰转移酶，通过乙酰化修饰抗生素使其失活。 ④四环素类（如四环素）作用机制：结合细菌核糖体 30S 亚基，阻止蛋白质合成。抗性基因原理：四环素抗性基因tetR编码膜蛋白，将抗生素泵出细胞。 05常用原核筛选抗生素的分类及作用机制真核表达系统中，将质粒转到真核细胞后，需要使用真核药物筛选出含有质粒的阳性细胞。 1. 氨基糖苷类衍生物（新霉素、庆大霉素）作用机制：干扰真核细胞核糖体（主要是 80S 核糖体）的功能，抑制蛋白质合成，导致细胞死亡。抗性基因原理：载体携带细菌来源的neoR（新霉素抗性基因），编码氨基糖苷磷酸转移酶，通过磷酸化修饰抗生素使其失活。 2. 嘌呤类似物抑制剂（嘌呤霉素）作用机制：结构类似氨酰 - tRNA，可掺入正在合成的多肽链，导致肽链合成提前终止，使细胞无法合成完整蛋白质而死亡。抗性基因原理：载体携带puroR基因，编码嘌呤霉素 N - 乙酰转移酶，通过乙酰化修饰抗生素使其失活。 3. 糖肽类抗生素（博来霉素）作用机制：嵌入 DNA 双链，引起 DNA 链断裂，抑制 DNA 复制和修复，最终导致细胞死亡。抗性基因原理：载体携带bleR基因，编码博来霉素结合蛋白，通过结合抗生素阻止其与 DNA 作用。 |
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