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科研战神来了

新虫 (小有名气)

[交流] KO细胞系构建详细教程~

✅基于CRISPR/Cas9的原理,在细胞中转染cas9/gRNA表达载体后,cas9-gRNA表达并切割,此时细胞分为四种:转染阴性、转染阳性(未被编辑、被编辑但未成功敲除、成功敲除);通过抗性可筛选出转染阳性细胞,但不能筛选出成功敲除的细胞,所以需要通过筛选单克隆得到成功敲除的细胞~
✅筛选单克隆的详细步骤在图二
✅一些小tips
1.一般一个细胞一个片段铺两个96孔板就行,一个板大概能挑出10来个单细胞克隆
2.大概长一周后才能在镜下找到细胞,这个时候克隆也不大,很好辨认是不是单细胞长出来的,有些孔里会有2-3个克隆
3.12孔板转移到6孔板先验证,验证好后成功敲除的细胞再消化一个到T25扩大培养即可,其它冻存备用
4.提蛋白时可以不用BCA定量,不需要内参很齐,收样前镜下看一下细胞密度,多的多加点裂解液,少的少加点裂解液,最后结果看有无,目的条带没有就是敲除了~

KO细胞系构建详细教程~


KO细胞系构建详细教程~-1


KO细胞系构建详细教程~-2


KO细胞系构建详细教程~-3


KO细胞系构建详细教程~-4


KO细胞系构建详细教程~-5


KO细胞系构建详细教程~-6
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