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科研战神来了新虫 (小有名气)
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[交流]
KO细胞系构建详细教程～
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✅基于CRISPR/Cas9的原理，在细胞中转染cas9/gRNA表达载体后，cas9-gRNA表达并切割，此时细胞分为四种：转染阴性、转染阳性（未被编辑、被编辑但未成功敲除、成功敲除）；通过抗性可筛选出转染阳性细胞，但不能筛选出成功敲除的细胞，所以需要通过筛选单克隆得到成功敲除的细胞～ ✅筛选单克隆的详细步骤在图二 ✅一些小tips 1.一般一个细胞一个片段铺两个96孔板就行，一个板大概能挑出10来个单细胞克隆 2.大概长一周后才能在镜下找到细胞，这个时候克隆也不大，很好辨认是不是单细胞长出来的，有些孔里会有2-3个克隆 3.12孔板转移到6孔板先验证，验证好后成功敲除的细胞再消化一个到T25扩大培养即可，其它冻存备用 4.提蛋白时可以不用BCA定量，不需要内参很齐，收样前镜下看一下细胞密度，多的多加点裂解液，少的少加点裂解液，最后结果看有无，目的条带没有就是敲除了～        |
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