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科研战神来了新虫 (小有名气)
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泛素化IP实验 | 详细步骤+小tips 已有1人参与
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泛素化IP实验步骤 一、制备细胞裂解物 1.实验组/对照组分别准备1个10cm圆皿的细胞，收集细胞前加MG132处理4-6h 2.弃旧培养基，PBS洗两遍，弃PBS 3.将皿置于冰上预冷，加入500-1000μL RIPA（100:1添加PMSF），冰上裂解10-15min后，用细胞刮将蛋白刮下，转移至1.5mL离心管 4.冰浴中对样品超声3-5次，每次3秒 1.4℃,16000g离心8min，将上清转移至新的离心管中，即为细胞裂解物二、共孵育（抗体＋蛋白） 1.取出40-100μL 样品作为input先放入-20或-80℃冰箱 2.在剩余样品加目的抗体（1-2μg），用封口膜将反应管封严 3.4℃旋转孵育过夜 三、共沉淀（加磁珠） 1.清洗磁珠（可以不洗，将原管磁珠重悬后取30μL加到反应管中即可）：用IP裂解液清洗磁珠3遍（磁力架），IP裂解液重悬磁珠（取多少μL就用多少液体量重悬），为了防止在吸取磁珠时枪头将磁珠损伤，可以将枪头用剪刀剪去前端一小部分使用 2.将磁珠加入到每个免疫沉淀反应中（30μL/管），重新封严反应管 3.4℃旋转孵育过夜*（这一步看很多Protocol都是孵育1-4h，之前我有个抗体做IP孵育4h没做出来，有次孵育过夜做出来结果很漂亮，后面就都是过夜孵育了） 四、清洗（洗去非特异结合） 1.将IP反应管取出置于磁力架上，将磁珠吸附至管壁，待溶液澄清后，将上清液去除，留磁珠 2.加1mL PBST，将样品管从磁力架取下，在4℃摩天轮旋转清洗3-5min，重复1和2步骤两次，即用PBST洗3次 3.加入1mL IP裂解液，将样品管从磁力架取下，在4℃摩天轮旋转清洗3-5min，将液体转移至新的离心管（原离心管可能吸附有蛋白，避免非特异），置于磁力架吸附磁珠，弃上清，再用IP裂解液洗1遍 *清洗液可以全部用PBS 五、洗脱（将蛋白从珠子上洗脱） 1.将Loading buffer用IP裂解液稀释成1x 2.每个IP反应管加入30-40μL 1x Loading buffer，涡旋混匀，金属浴100℃煮样5-10min，即制样完成 3.将离心管放入磁力架，取上清进行上样电泳 ⭐泛素化IP实验和coIP实验差不多，但有些地方不同～下面讲一下泛素化IP实验比较关键的点 收样前需要加MG132处理4-6小时，目的为了“冻结”和“富集”处于泛素化状态的蛋白质，从而增强实验信号，确保能够成功检测到通常瞬态且低丰度的泛素化修饰。 ✅为什么泛素化IP可以用强裂解液而coIP不能？ Co-IP的目的是捕获蛋白A和蛋白B之间天然状态下的物理结合，强裂解液中的SDS和强去污剂会破坏氢键、疏水区域等，从而瓦解蛋白质的三级/四级结构和非共价相互作用。一旦蛋白质变性，其表面的结合位点就会消失，A和B之间的自然相互作用就会被彻底破坏。 泛素化IP的目的是证明泛素分子是否通过共价键连接在了目标蛋白上，强去污剂和低浓度的SDS无法破坏这种共价连接。使用强裂解液可以彻底变性目标蛋白，使被泛素化的目标蛋白完全展开，暴露出原本藏在内部的泛素化位点，让抗体更容易结合；强裂解液可以解离所有非共价的、假性的相互作用，消除非特异结合 ✅泛素化IP样品处理时需要超声，充分暴露泛素化位点 跑泛素化条带时一定要用避免轻重链二抗，泛素化修饰的典型WB特征是一个连续的拖尾或涂抹状条带，重链的强信号条带会影响泛素化条带的检出，用普通二抗只能曝出重链，用了避免轻重链二抗后泛素条带就可以曝出来了。 |
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