| 查看: 593 | 回复: 0 | ||
[交流]
蛋白煮样后变沉淀？4℃保存的“坑”与解决秘籍
|
|
做实验的时候是不是经常遇到这种烦心事：蛋白煮样后放在4℃保存，过段时间就出现白色沉淀或者变粘稠了。这到底是为啥呢？超实用的解决方法！ 蛋白煮样后变沉淀，背后的原因竟是这些 首先得知道，Loading Buffer里含有SDS（十二烷基硫酸钠），它是一种阴离子表面活性剂。SDS的溶解度可随温度降低而显著下降哦。当环境温度低于临界析出温度（通常为15-20℃，具体取决于浓度）时，SDS单体溶解度会急剧降低，胶束解离就会析出白色絮状沉淀。特别是在低温条件下，SDS分子间的疏水相互作用增强，形成不溶性聚焦体。比如在色谱柱中，流动相温度低于SDS临界温度，析出的SDS可能堵塞柱体，影响分离效果。 那为啥蛋白煮样后，放置4℃保存一段时间就会出现白色沉淀或变粘稠呢？主要有以下几个原因： 1. SDS-蛋白质复合物的不稳定性 虽然SDS能帮助变性的蛋白质溶解，但这种溶解状态并不是绝对稳定的。特别是对于疏水性强的蛋白质（膜蛋白）、部分变性不完全的蛋白质以及浓度很高的蛋白质样品，更容易出现不稳定的情况。 2. 温度降低（4℃） 温度降低会减弱分子热运动，使得分子间的相互作用更加容易发生。要知道，疏水相互作用在低温下会减弱，但并不会完全消失。主要是因为低温会降低SDS的溶解度，使得一部分SDS分子从蛋白质-SDS复合物上脱离。 3. 时间因素 随着时间的推移，SDS会逐渐从蛋白上解离。虽然这个过程很缓慢，但是一直在持续。一旦SDS的“保护层”变薄或出现空缺，那些暴露出来的疏水区域就会相互“寻找”并聚集在一起，通过疏水相互作用结合在一起。这种聚集体慢慢形成，最终出现肉眼可见的白色絮状物沉淀，而这种沉淀是变性的、聚集的蛋白质混合物。 4. 其他成分的影响 上样缓冲液中通常含有甘油，它们主要用于增加样品的密度，方便上样。而甘油在低温下，粘度增大，可能会促进大分子聚集体的形成和沉降。 遇到沉淀别慌，这些方法帮你搞定 要是遇到蛋白煮样后出现沉淀的情况，别着急，试试这些方法： 1. 再次煮样 一般情况下，可以通过涡旋后再次煮样10分钟，离心后再进行上样。如果放置的时间不是很久，可以直接涡旋离心后再上样。 2. 优化保存条件 尽量避免在4℃长期保存煮样后的蛋白样品。如果需要保存，可以考虑在室温保存，但要注意防止样品变质。或者在保存过程中适当添加一些稳定剂，比如少量的蔗糖或甘油，来减少沉淀的形成。 3. 调整样品浓度 适当降低蛋白样品的浓度，避免过高浓度导致SDS-蛋白质复合物的不稳定。这样可以减少沉淀的产生。 4. 注意缓冲液成分 在配制上样缓冲液时，注意甘油的用量，避免过多的甘油在低温下增加粘度，促进沉淀的形成。 毕合生物(www.bihebio.com)提供服务内容：分子生物学、免疫, 重组蛋白及ELISA相关、活性小分子化合物、高端化学、材料化学、细胞资源库与培养相关、生命科学、天然产物 |
回复此楼
