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细胞动不动一下就「长满」！原来是没有学会它！
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细胞计数是细胞培养实验的一项基本功，遥想当年，刚进入实验室做细胞实验时，最让大家头疼的就是给细胞计数了，虽然比较简单，但是经常晕头转向、数到眼瞎，且一个不小心被其他人打断了思路，分分钟前功尽弃。细胞计数的方法有很多种，最常见也是最直接的方法有血细胞计数板、电子计数仪、流式细胞计数等。还有一些间接判断细胞数量的方法，如结晶紫染色、MTT分析等。 01计数板准备 使用双蒸水或者70%-75%乙醇，将盖玻片和细胞计数板进行清洁晾干备用。再将晾干的盖玻片轻轻覆盖至血细胞计数板上，放在显微镜下，观察计数格位置是否是洁净的。 值得注意的是，使用前须保证盖玻片和计数板已充分晾干，否则将影响后续细胞充池及计数结果；一般使用乙醇清洁比较多，乙醇可快速挥发，干燥比较快；如需要擦拭，最好使用擦镜纸擦拭。 02制备细胞悬液 样本制备是细胞计数的第一步，也是至关重要的一步。细胞的活性和分散程度直接影响计数结果，如果细胞悬液制备不当，出现细胞团聚或沉淀，就会导致计数时重复计数或漏计，从而使结果不准确。例如在制备肿瘤细胞悬液时，需要使用适当的消化酶将细胞从组织块中分离出来，消化时间过长或过短都会影响细胞的活性和分散效果。消化时间过长，细胞会被过度消化，导致细胞膜破损，细胞死亡；消化时间过短，细胞则无法充分分离，容易形成团块。 对于贴壁生长的细胞，我们需要首先使用胰酶消化的方法使细胞从培养皿表面脱落，并加入适当的含血清培养基，中和胰酶的作用并重悬细胞，以得到均质的细胞悬液。并稀释到合适的倍数。如果需要计算细胞的活率，则需要将细胞悬液和0.4%台盼蓝等体积混合;室温孵育3~5分钟，使台盼兰完全进入死细胞，使死细胞着蓝色(注: 悬浮细胞染色时间可视情况适当延长)。 03血细胞计数板加样 充池是将细胞悬液引入计数板计数区域的过程。这一步骤要求操作轻柔、迅速，避免产生气泡，气泡的存在会占据计数区域的空间，干扰细胞的观察和计数。同时，充池后要等待细胞沉降一段时间，使细胞均匀分布在计数区域内，再进行计数，如果过早计数，细胞可能还未完全沉降，会导致计数结果偏低；如果等待时间过长，细胞可能会因干燥或死亡而影响计数准确性。 值得注意的是，若需进行多个样品的计数，应尽量保证每次充池的体积一致一般在10 μL/池左右，如果计数数内未充满细胞，或者过多都将影响计数结果；操作时，盖玻片下不能有气泡，也不能使细胞悬液流入另一个样品池中，否则需要重新清洗计数板重新加样计数。 04 细胞计数 在显微镜下观察细胞时，要选择合适的放大倍数和光线强度，以确保能够清晰地看到细胞。计数时，要遵循一定的计数规则，如“数上不数下，数左不数右”，避免重复计数或漏计。此外，对于形态不规则或难以辨认的细胞，要结合细胞的特征和经验进行准确判断。例如在计数白细胞时，要根据细胞的核形态和细胞质的特点区分不同类型的白细胞，如中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等。 05细胞浓度计算 由下图可以得出，每个大方格的容积为: 1mm2 × 0.1mm=0.1mm3=10-4cm3= 10-4mL，在常规没有使用台盼蓝染色时，可以以下面公式计算每毫升样品中细胞的个数: 每毫升样品中细胞的个数=每个大方格内细胞的平均数 x细胞稀释倍数x104。 06影响细胞计数结果的因素 1. 细胞类型与状态不同类型的细胞具有不同的形态和大小，其计数方法也可能有所差异。例如红细胞体积较小，数量众多，计数时需要采用特定的稀释倍数和计数方法；而白细胞体积较大，数量相对较少，计数时需要更加仔细地观察和区分。此外，细胞的生长状态也会影响计数结果。处于对数生长期的细胞活性高、分散性好，计数结果相对准确；而处于衰老期或凋亡期的细胞则容易出现团聚或变形，影响计数准确性。2. 环境因素环境温度、湿度和pH值等因素也会对细胞计数产生影响。温度过高或过低会影响细胞的活性和代谢，导致细胞死亡或变形；湿度过低会使细胞悬液蒸发，导致细胞浓度升高；pH值的变化会影响细胞的电荷分布和分散状态，从而影响计数结果。因此，在进行细胞计数时，要尽量保持环境条件的稳定，为细胞提供一个适宜的生存环境。 |
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