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Coip实验protocol 和tips，以及如何避免IgG过浓而掩盖趋势
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收集细胞+裂解细胞(这两步骤内源和外源co-ip一样操作)-.做co-ip的细胞量:原则:细胞量不宜少，一般是一个10cm皿的细胞量起步，悬浮细胞1000~3000万都可以，贴壁细胞大概一整盘10cm皿贴满皿底的量，若贴壁细胞一颗比较大，建议用两盘去做ip。 二，裂解细胞: 首先:500-1亦00rpm*5min离心去掉上清培养基，PBS重悬洗一遍。(1mIPBS)。PBS预冷，在冰上或者4度放置。 其次:裂解细胞悬浮细胞嗐:细胞收集到EP管内，加适量IPBuffer裂解液(10cm大皿的细胞量可加1m裂解液)，吹匀细胞冰上裂解30-60min，每隔10min上下颠倒4-5次防止细胞沉淀无法 裂解。 贴壁细胞:可用ipbuffe直接冰上刮细胞，也可采取悬浮细胞的方法，从而达到裂解的效澕捕盘右外屏銖洳夀沅啖 最后鑹险摜堊鲻铧裂解訉奪潯徵杖者毕后，4度离心机12000rpm*20min离心，取上清蛋白放置新的EP管中。 !注意事项: 1、用IP Buffer裂解液。(自配or成品) (用于裂解细胞的IP Buffer要加防止蛋白降解的抑制剂，抑酶，亮素，PMSF等重点是:一定要加!) 2、做ip的裂解液比较温和，是为了防止破坏蛋白结合，因此不宜超声，只可冰上裂解。 3、裂解液因温和，裂解效果相对不那么充分，因此用较多的细胞，较多的裂解液。般1个10cm皿的细胞量+1ml裂解液。悬浮细胞大概采用2000万，贴壁就是一个10cm满皿的量。 (自配裂解液:冰上裂解，10min一次上下摇匀，裂1~2个小时都是可以的，裂解时间久点，更充分。 (成品裂解液:冰上裂解15-20min即可，不同品牌有差别，例如ACE的buffer是15min) 4淜嘱直付裂Ⓤ现解完賧投细臒唝醬胞以后4度离心12000rpm离心30min，离心完会发现还有部分细胞没裂解沉底了，是正常现象，吸取上清到新的管子里，准备加一抗or纳米beads。 Coip蛋白样品制作 加抗体: 分为两种情况: 第一种:ip目的蛋白，则采用一抗和beads分开的产品。加一抗孵育过夜: 这里有个重要的问题是蛋白定量，需不需要定量看实验目的，若要定量，蛋白定量之后再加一抗。1.如果只做一组，单纯的定性实验，也就是看二者之间有没有结合，无需定量。2.如果做多组，经过处理(例如:加药，转染等)后看二者之间的结合有没有变多或者减少，那就要定量。定量原则:保证被ip的蛋白量基本一致，一般3~4mg左右就足够了，最起码2mg，保证每组都这个量，被ip的蛋白才会基本保持一致，才能看趋势。过夜以后加beads: 琼脂糖proteinA+G，加40ul，加珠子时，把枪头剪个口，以防挂壁太多，尽可能加准加了beads以后4度摇3~4小时，然后洗珠子。(不同品牌不一样，根据自己使用的beads使用量做即可) 第二种:ip标签蛋白，则采用带一抗的beads 四，洗beads:敲重点:洗珠子一定要悬空加洗液进入EP管，不要吹打!!!(磁力架也可)beads很轻，悬空加，借洗液冲力吹起珠子，达到洗涤目的。washingbuffer可以用的未加抑制剂的ipbuffer，也可以用pbs洗，每次用1ml去洗。离心或鏌滥瑩骒韁博者用凵磁錚糇錨力架，看自己实验室习惯，4500rpm离心3min，洗5次，最后空用一遍，空甩完把剩余的洗涤液尽可能吸干净，只留besds，但是不要吸到besds，残留一点没关系。 五，加loading:洗完beads后加和beads量一样的2*loading。例如beads加40u，loading也加40ul。加了以后用10u小枪头轻轻搅拌，不要吸，只搅拌，搅拌的loading和beads充分融合紧接着去煮，100度煮5min，蛋白样品制作完成。 避免IgG过浓的小技巧总结 1、异源抗体的使用(可部分避免);举例:鼠抗做ip，免抗做wb。 2、无IgG二抗的使用(可部分避免):可采用去除轻重链的二抗孵育，而不是普通二抗。3、外源性coip，纳米抗体的使用(偶联抗体和beads，且去除IgG);4、外源性coip，质粒尽可能带标签(例如Flag);标签很容易putdown下来，可一定程度增强丰度，不被IgG掩盖5、洗beads可多洗几次，5次起，可增加到6-8次;6、加一抗需要注意的点: 抗体浓度;IgG，标签抗体，目的蛋白抗体原管浓度都是不一致的，一般情况下都是IgG浓度最高，其次标签，目的蛋白抗体浓度最低。蛋白丰度:细胞内IgG含量远远高于目的蛋白 因此，加一抗时不要等体积添加，注意按一抗质量添加。也就是说，，一般情况下，IgG一抗的使用量要比目的蛋白少很多倍，具体情况具体分析! 7、保证使用目的蛋白可以轻松put down的使用量，使用较为好用的一抗去putdown目的蛋白。 |
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