| 查看: 360 | 回复: 0 | |||
[交流]
类器官染色与功能验证技术指南——高级功能验证
|
|
这是类器官模型价值和应用潜力的终极体现，证明其不仅“形似”，更能“神似”。 屏障功能检测： 目的： 评估具有屏障功能的类器官（如肠道、血脑屏障、肾小管）的完整性。 方法： 跨上皮电阻测量： 使用电极测量类器官单层或囊腔两侧的电阻值，高TEER值表示屏障紧密完整（常用于Transwell培养的类器官单层）。 荧光示踪剂渗透性实验： 将荧光标记的分子（如FITC-葡聚糖，分子量不同）加到腔外侧或顶端，定时检测对侧（基底侧或囊腔内）的荧光强度。渗透率低表明屏障功能好。 分泌/吸收功能检测： 目的： 评估类器官是否具有合成和分泌特定物质（激素、酶、粘液、胆汁酸等）或吸收营养物质的能力。 方法： ELISA/化学发光/质谱： 检测培养上清液中目标分子的浓度（如肠类器官分泌MUC2、胰高血糖素样肽；肝类器官分泌白蛋白、尿素；脑类器官分泌神经递质）。 功能吸收实验： 在培养液中加入荧光标记或放射性标记的底物（如葡萄糖、脂肪酸、胆汁酸），检测类器官细胞内的摄取量。 代谢功能检测： 目的： 评估类器官（尤其是肝脏）的代谢能力（药物代谢、解毒、能量代谢）。 方法： CYP450酶活性检测： 使用特异性底物（如CYP3A4底物咪达唑仑），检测其代谢产物生成速率。 尿素合成检测： 在含氨的培养液中孵育，检测尿素生成量。 糖原储存/释放检测： PAS染色或生化检测糖原含量。 线粒体功能检测： 使用Seahorse等仪器测量耗氧率，评估能量代谢状态。 电生理活性检测 (主要用于神经、心肌类器官)： 目的： 检测神经元放电活动或心肌细胞搏动及其特性。 方法： 钙成像： 使用Fluo-4, Fura-2等钙离子荧光指示剂，通过活细胞成像观察细胞内钙瞬变，反映神经元或心肌细胞的电活动及其同步化程度。 膜片钳： 微电极直接记录单个细胞的膜电位或离子通道电流（分辨率最高，但技术难度大）。 微电极阵列： 在培养皿底部集成电极网格，非侵入性地记录类器官群体水平的场电位或动作电位发放。 药物/毒性反应测试： 目的： 验证类器官对已知药物或毒素的生理/病理反应是否与体内一致，评估其用于药筛或毒理研究的可靠性。 方法： 将类器官暴露于不同浓度药物/毒素。 表型观察： 形态变化（萎缩、空泡化、结构破坏）、活性/死亡变化（活死染色）。 功能检测： 屏障功能、分泌功能、代谢功能的变化。 分子检测： 特定基因表达（qPCR）、蛋白表达（WB/IHC/IF）或信号通路激活（Phospho-specific抗体）的变化。 鉴定要点： 剂量效应关系、时间效应关系是否与已知的体内/临床数据相符？是否能区分不同作用机制的药物？ 遗传操作与表型验证： 目的： 利用CRISPR/Cas9等技术在类器官中引入特定基因突变（疾病建模）或过表达/敲除基因（功能研究），然后通过上述各种染色和功能方法验证表型变化（如形态异常、增殖/凋亡失衡、功能缺陷），证明基因型-表型关联。 确保可靠性与准确性的关键点 标准化操作流程 (SOPs)： 从组织取材、解离、培养条件（培养基成分、基质胶批次、气体环境）、传代方法到染色/检测步骤，都需要严格标准化，减少批次差异。 严格的质量控制 (QC)： 起始细胞/组织： 明确来源（患者？动物？细胞系？），伦理合规，记录病史/基因型。 形态学QC： 每批类器官都需要通过明场和H&E染色进行基本形态学合格判定。 标志物QC： 定期进行关键细胞类型标志物的免疫染色，确认细胞组成稳定。 无菌/支原体检测： 定期进行。 设立适当的对照： 阳性对照： 已知表达目标蛋白的组织切片或细胞。 阴性对照： 同一样品进行染色但不加一抗（空白对照），或用同型IgG代替一抗（同型对照）。 生物学对照： 健康的vs疾病的类器官，处理的vs未处理的类器官。 技术对照： 不同批次实验间的重复。 定量化分析： 尽可能使用图像分析软件对染色结果进行定量（阳性细胞计数、荧光强度分析、结构参数测量），减少主观判断误差。 多参数、多层次验证： 不要仅依赖单一染色或方法。结合形态、多种标志物、功能测试进行综合评估。 与体内组织比较： 始终将类器官的表型（形态、标志物、功能）与对应发育阶段或成体的体内组织作为金标准进行比较。 数据记录与可重复性： 详细记录所有实验条件、试剂批次、染色参数和分析方法，确保结果可被他人重复。 |
回复此楼» 猜你喜欢
请问哪里可以有青B申请的本子可以借鉴一下。
已经有4人回复
-
真诚求助：手里的省社科项目结项要求主持人一篇中文核心，有什么渠道能发核心吗
已经有6人回复
-
孩子确诊有中度注意力缺陷
已经有14人回复
-
三甲基碘化亚砜的氧化反应
已经有4人回复
-
请问下大家为什么这个铃木偶联几乎不反应呢
已经有5人回复
-
请问有评职称，把科研教学业绩算分排序的高校吗
已经有5人回复
-
2025冷门绝学什么时候出结果
已经有3人回复
-
天津工业大学郑柳春团队欢迎化学化工、高分子化学或有机合成方向的博士生和硕士生加入
已经有4人回复
-
康复大学泰山学者周祺惠团队招收博士研究生
已经有6人回复
-
AI论文写作工具：是科研加速器还是学术作弊器？
已经有3人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
