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科研战神来了新虫 (小有名气)
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WB实验新手指南:如何选择合适的内参
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Western blot实验，与RT-qPCR实验一样，都是用来探究基因表达情况的，不过它们关注的层面不同。RT-qPCR是在RNA水平上看基因是怎么表达的，而Western blot则是在蛋白质层面上进行探究。在进行Western blot实验时，我们需要找到一个在大多数情况下表达都相对稳定的基因，这个基因就是内参基因。它就像一个“标尺”，让我们能够更准确地衡量其他基因（也就是我们的目的基因）的表达情况。 当我们想要知道某个实验处理对目的基因表达有什么影响时，就会用到这个“标尺”。我们先挑选出适合的内参基因，然后在实验组和对照组中分别检测它和目的基因的表达量。通过比较这两组数据中目的基因相对于内参基因的表达量，我们就能看出实验处理对目的基因表达产生了怎样的影响。 一.什么是内参基因 内参基因：也被称为管家基因或持家基因，是生物体或细胞中持续并稳定表达的基因。这些基因编码的产物是维持细胞基本生命活动所必需的。 内参基因的特点： ⚫稳定性：内参蛋白的表达水平在不同实验条件、细胞类型和组织中保持相对稳定，这是其作为内参的基础。 ⚫普遍性：内参蛋白广泛存在于多种组织和细胞中，便于在各种实验中使用。 ⚫易检测性：内参蛋白通常具有较高的表达量，易于检测内参的作用：1. 标准化样品上样量内参蛋白是细胞中稳定表达且量相对恒定的蛋白质。通过检测内参蛋白，可以确保每个样品的蛋白质上样量是一致的，避免因样品上样量差异导致的结果误差。 2. 校正实验误差在Western Blot实验过程中，从样品制备、蛋白质提取、电泳到转膜等多个步骤中可能会引入技术误差。内参蛋白的信号可以用来校正这些步骤中可能出现的变动，确保实验结果的可靠性。 3. 数据定量分析在进行目标蛋白的定量分析时，通常会将目标蛋白的信号强度与内参蛋白的信号强度进行比值计算。这种比值计算方法能够更准确地反映目标蛋白在不同样品中的相对表达水平，排除由于实验条件和处理不同导致的变化。 如何选择合适的内参？ 一.针对样本而言：在选择内参蛋白时，我们首先需要考虑样品的物种来源以及目的蛋白的表达部位，如全细胞、细胞核、细胞质、细胞膜或血清、血浆样本等。 🔷全细胞：常用的内参蛋白包括GAPDH、β-肌动蛋白（β-actin）和β-微管蛋白（β-tubulin）。这些蛋白在大多数哺乳动物细胞中表达稳定，且分子量适中，易于检测。🔷细胞核：对于核蛋白的研究，可以选择Histone H3和Lamin等作为内参。Histone H3是核蛋白的重要组成部分，而Lamin则与核膜的稳定性有关。🔷细胞膜：针对细胞膜蛋白的研究，ATP1A1是一个合适的选择。它是细胞膜上的重要离子泵，表达稳定。🔷线粒体：对于线粒体蛋白的研究，可以选择VDAC1作为内参。VDAC1是线粒体外膜上的一种重要蛋白质，分子量约为30kDa。🔷血浆样本：由于这些样本没有完整的细胞结构，可以选择Albumin（白蛋白）作为内参。它是血清和血浆中最丰富的蛋白质之一，表达稳定。 二.根据蛋白量选择 根据目的蛋白的大小，考虑合适的内参蛋白，一般目的蛋白和内参蛋白的分子量相差5kD以上。但是也并不是内参蛋白和目的蛋白的大小相差越大越好的，需要考虑转膜时间等 三.考虑目的蛋白的表达部位 在蛋白质提取的研究中，有时候会选择分别提取细胞的胞浆（细胞质）和胞核中的蛋白质，而不是提取整个细胞的总蛋白。这样做的好处是可以更精确地研究特定部位（胞浆或胞核）的蛋白质功能。 β-actin是一种在胞浆中高效且稳定表达的蛋白质，由于总蛋白中胞浆蛋白占比较大，因此β-actin常被用作总蛋白研究中的内参蛋白。然而，由于β-actin主要在胞浆中表达，在细胞核内几乎不表达，因此它不能作为胞核蛋白研究的内参。对于胞核蛋白的研究，会选择那些在胞核中特异性表达的蛋白质作为内参，比如PCNA和Histone H3等。 同样地，如前描述的对于其他细胞部位（如核膜、线粒体）的蛋白质研究，也需要选择相应部位特异性表达的蛋白质作为内参。例如，Lamin B可以作为核膜蛋白研究的内参，而COXIV和VDAC1则可以作为线粒体蛋白研究的内参。 |
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