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色谱定量的四大方法，实验小白也能轻松掌握
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做色谱实验，定量分析可是关键一步！色谱定量的四大方法，让你的实验结果又准又稳。 1️⃣ 色谱定量的“秘密武器” 色谱定量主要依赖两个关键依据： 检测器的线性响应关系：大多数色谱检测器（除了FPD）都遵从线性响应，即检测器响应信号的大小与单位时间到达检测器的被测物质的总量成正比。用公式表示就是：m = KS，其中m是待测物质的量，K是线性响应系数，S是检测器响应信号的值。 塔板理论：塔板理论阐述了峰高与进样量之间的关系，它们是成正比的。也就是说，峰高和峰面积都与进样总量成正比，但峰面积的代表性更好，因为峰形经常不完全满足正态分布，而峰面积在大多数情况下都能很好地代表待测物质的总量。 2️⃣ 四大定量方法大比拼 ① 归一化法 归一化法是把所有出峰的组分含量之和按100%计的定量方法。这种方法特别适合各成分校正因子一致的情况，优点是简便、准确，特别是进样量不容易准确控制时，进样浓度及进样量的变化对定量结果的影响很小。其他操作条件，如流速、柱温等变化对定量结果的影响也很小。这种方法在GC（气相色谱）和HPLC（高效液相色谱）中广泛应用。 ② 外标法（标准曲线法） 外标法是通过绘制标准工作曲线来进行定量分析的方法。具体步骤是：用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与欲测组分相同的色谱条件下，等体积准确量进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准工作曲线。标准工作曲线应是通过原点的直线。如果标准工作曲线不通过原点，说明测定方法存在系统误差。外标法的优点是操作简单，适合大量样品分析，但缺点是对色谱条件的稳定性要求较高，容易出现较大误差。 ③ 内标法 内标法是选择适宜的物质作为欲测组分的参比物，定量加到样品中去，依据欲测组分和参比物在检测器上的响应值（峰面积或峰高）之比和参比物加入的量进行定量分析的方法。内标法的关键是选择合适的内标物，内标物应是原样品中不存在的纯物质，性质应尽可能与欲测组分相近，不与被测样品起化学反应，同时要能完全溶于被测样品中。内标法的优点是进样量的变化和色谱条件的微小变化对定量结果的影响不大，特别适合样品前处理过程中欲测组分可能发生变化的情况。缺点是选择合适的内标物比较困难，操作较麻烦。 ④ 标准加入法 标准加入法实质上是一种特殊的内标法，是在选择不到合适的内标物时，以欲测组分的纯物质为内标物，加入到待测样品中，然后在相同的色谱条件下，测定加入欲测组分纯物质前后欲测组分的峰面积（或峰高），从而计算欲测组分在样品中的含量的方法。标准加入法的优点是不需要另外的标准物质作内标物，只需欲测组分的纯物质，进样量不必十分准确，操作简单。缺点是要求加入欲测组分前后两次色谱测定的色谱条件完全相同，否则将引起分析测定的误差。 3️⃣ 选择合适的方法 归一化法：适合各成分校正因子一致，进样量难以控制的情况。 外标法：适合大量样品分析，色谱条件稳定的情况。 内标法：适合样品前处理过程中欲测组分可能发生变化的情况。 标准加入法：适合无法精确进样，且无法选择合适内标物的情况。 毕合生物提供服务内容：分子生物学、免疫, 重组蛋白及ELISA相关、活性小分子化合物、高端化学、材料化学、细胞资源库与培养相关、生命科学、天然产物 |
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