| 查看: 678 | 回复: 0 | |||
[交流]
CRISPR筛选发现新线索，iTreg细胞疗法更进一步
|
|
调节性 T 细胞（Treg）作为免疫系统的 “守护者”，通过特异性表达转录因子 FOXP3 维持免疫耐受，其功能缺陷会导致自身免疫病等多种疾病。然而，体外诱导的 iTreg 细胞因 FOXP3 表达不稳定，始终是细胞疗法临床转化的 “绊脚石”。2025 年发表于《Nature》的研究 “Genome-wide CRISPR screen in human T cells reveals regulators of FOXP3”，通过全基因组 CRISPR 筛选技术，系统性挖掘 FOXP3 调控基因，发现 RBPJ 是 iTreg 分化的关键负调控因子，为优化 iTreg 细胞疗法提供了全新靶点和机制解释。 一、研究背景：iTreg 细胞的 “稳定性困境” 自然调节性 T 细胞（nTreg）在胸腺中发育成熟，FOXP3 表达稳定；而体外通过 TGFβ 和 IL-2 诱导 naive CD4+T 细胞生成的 iTreg 细胞，常因 FOXP3 表达波动丧失功能。这种不稳定性源于 FOXP3 基因调控网络的复杂性 —— 已知 TGFβ-SMAD 通路、表观遗传修饰（如 CNS2 区域甲基化）参与调控，但全基因组范围内的关键调控因子仍不明确。 研究团队指出，传统研究多聚焦于 nTreg 的维持机制，而 iTreg 的分化调控尚未被系统解析。因此，通过无偏倚的全基因组筛选技术，挖掘影响 FOXP3 诱导的关键基因，成为突破 iTreg 稳定性难题的核心策略。 二、技术核心：全基因组 CRISPR 筛选的 “高精度搜索” 为系统性寻找 FOXP3 调控基因，研究团队建立了基于 SLICE（sgRNA 慢病毒感染结合 Cas9 电穿孔）的 CRISPR 筛选平台，其设计堪称 “基因层面的显微镜”。 1. 筛选设计：锁定 FOXP3 表达差异的细胞群体 研究采用覆盖 19113 个基因的 sgRNA 文库（77491 条 sgRNA，每个基因 4 条），转染人原代 naive CD4+T 细胞后，通过 TGFβ、IL-2 等诱导 iTreg 分化。72 小时后，通过流式细胞术将细胞分为 FOXP3high（高表达）和 FOXP3low（低表达）两组，利用 MAGeCK 软件分析两组 sgRNA 的富集差异，锁定调控基因。 筛选结果显示，已知调控因子（如 TGFBR1、SMAD3）的出现验证了方法可靠性，更重要的是发现了 SMARCB1、MIDN 等新候选基因。其中，RBPJ 作为负调控因子表现突出 —— 其 sgRNA 在 FOXP3high 细胞中显著富集，提示 RBPJ 缺失可促进 FOXP3 表达（图 1b,c）。 2. 验证策略：从筛选到单基因功能确认 为排除假阳性，团队通过 Cas9-gRNA 核糖核蛋白（RNP）进行单基因敲除验证。结果显示，RBPJ 敲除后，FOXP3 + 细胞比例和平均荧光强度（MFI）均显著升高，且在 5 名独立供体中趋势一致，证明其调控作用的稳健性（图 1e,g）。 图 1. 在原代人T细胞中进行的全基因组CRISPR筛选揭示了调控FOXP3诱导的新型因子 三、机制解析：RBPJ 如何 “抑制” FOXP3 表达？ RBPJ 作为 Notch 通路的经典下游分子，其调控 FOXP3 的机制却独立于 Notch 信号，这一发现颠覆了传统认知。 1. 不依赖 Notch 的 “独立行动” 实验显示，干扰 Notch 通路关键分子（如 NOTCH1、MAML1）对 FOXP3 表达无显著影响，而 RBPJ 敲除仅在 iTreg 中增强 FOXP3 表达，对 nTreg 无明显作用。这提示 RBPJ 的调控具有 “细胞类型特异性”，且与 Notch 通路无关（图 3b）。 2. 与 NCOR-HDAC3 复合体的 “协同抑制” 进一步研究发现，RBPJ 通过 β- 三叶形 DNA 结合域与 NCOR（核受体共抑制因子）-HDAC3 复合体结合，直接作用于 FOXP3 启动子。ChIP-seq 实验证实，RBPJ 缺失后，FOXP3 基因区域的 H3ac、H3K9ac（激活型组蛋白修饰）水平升高，而 HDAC3 抑制剂可逆转 RBPJ 过表达对 FOXP3 的抑制，证明其通过组蛋白去乙酰化抑制转录（图 2f,g）。 图 2. RBPJ–NCOR–HDAC3 复合体通过调控局部组蛋白乙酰化直接抑制 FOXP3 的表达 3. 表观遗传的 “双重调控” 除直接抑制转录，RBPJ 还影响 FOXP3 的表观遗传稳定性。RBPJ 敲除后，FOXP3 基因 CNS2 区域（与长期表达相关）的 CpG 甲基化水平显著降低，且这种去甲基化依赖抗坏血酸（维生素 C），提示 RBPJ 可能通过抑制去甲基化酶活性维持 CNS2 甲基化（图 3g）。 图 3. 敲除RBPJ可提升iTreg细胞中FOXP3的表达、功能与稳定性。 四、功能延伸：Perturb-icCITE-seq 揭示调控网络 为解析 RBPJ 的全局调控效应，团队采用 Perturb-icCITE-seq 技术 —— 结合 CRISPR 扰动与单细胞蛋白 - 转录组分析，同时检测 296 个候选基因敲除后的转录组和 300 多种蛋白表达变化。 结果显示，RBPJ 敲除后，iTreg 的核心功能基因（如 IL2RA、ENTPD1）表达上调，免疫抑制分子（CTLA4、CD39）蛋白水平升高，提示其功能增强。通过共功能模块分析，RBPJ 被归为模块 H，与 NCOR 复合体（模块 I）的调控特征不同，进一步支持其独立调控作用（图 2d,e）。 更关键的是，该技术验证了 FOXP3 蛋白与 sgRNA 富集的强相关性（r=-0.71），证明 RBPJ 对 FOXP3 的调控是直接且特异性的（图4c）。 图 4. 利用 Perturb-icCITE-seq 技术对 FOXP3 调控因子进行验证 五、临床潜力：RBPJ 敲除 iTreg 的 “功能跃升” 从基础机制到临床前验证，研究团队通过系列实验证实 RBPJ 敲除可显著提升 iTreg 的治疗潜力。 1. 体外功能：稳定性与抑制能力双提升 在重复 TCR 刺激和 TNF（炎症因子）处理下，RBPJ 敲除 iTreg 的 FOXP3 + 细胞比例仍保持 70% 以上，显著高于对照组（约 40%）。抑制实验显示，其对 CD4+、CD8 + 效应 T 细胞的增殖抑制能力提升 2-3 倍，且在 1:16 的低比例下仍有效（图 5）。 图 5. 抑制实验证实，RBPJ 缺失的 iTreg 细胞具有更强的抑制活性。 2. 体内验证：在 GvHD 模型中展现治疗优势 在人源化小鼠模型中，输注 RBPJ 敲除 iTreg 的小鼠生存率达 80%，显著高于对照组（输注 nTreg 的小鼠生存率约 70%，输注对照 iTreg 的小鼠仅 30%）。同时，体重下降幅度更小，5 天后仍有 91.5% 的细胞保持 FOXP3 高表达，证明其体内稳定性（图 6b,c,d）。 图 6. RBPJ 缺失可增强 iTreg 的体内稳定性及抑制功能 六、技术创新：聚焦 FOXP3 + 细胞的 “精准分析工具” 为克服传统方法难以聚焦特定细胞群体的局限，研究团队开发了三项新技术，为表观遗传和转录组分析提供 “靶向视角”： icRNA-seq：通过流式分选 FOXP3 + 细胞后提取 RNA，精准分析其转录组，避免 FOXP3 - 细胞的干扰； inChIP-seq：针对 FOXP3 + 细胞进行染色质免疫共沉淀，揭示 RBPJ 对 FOXP3 启动子组蛋白修饰的影响； inATAC-seq：分析 FOXP3 + 细胞的染色质开放性，发现 RBPJ 缺失可增强 FOXP3 启动子和 CNS2 区域的开放性。 这些技术解决了 “混合细胞群体分析掩盖关键信号” 的难题，为其他转录因子的细胞特异性调控研究提供了范式。 七、意义与展望：从基础研究到细胞疗法的 “桥梁” 这项研究不仅揭示了 FOXP3 调控的新机制，更为 iTreg 细胞疗法提供了切实可行的优化策略： 理论突破：发现 RBPJ 这一新型调控因子，完善了 FOXP3 的表观遗传调控网络，解释了 iTreg 与 nTreg 在稳定性上的差异。 临床潜力：通过敲除 RBPJ 增强 iTreg 的稳定性和功能，为自身免疫病（如类风湿关节炎）、器官移植排斥等疾病的细胞疗法提供了新方案。 技术启发：全基因组 CRISPR 筛选结合单细胞多组学的策略，为其他细胞命运调控的研究提供了可借鉴的范式。 从基因层面的 “地毯式搜索” 到细胞功能的 “全面升级”，这项研究让我们离 “可控、稳定的 iTreg 疗法” 更近了一步。或许在不久的将来，经过 RBPJ 调控优化的 iTreg 细胞，能像训练有素的 “维和部队” 一样，精准守护我们的免疫系统，为无数患者带来希望。 源井生物依托自主研发的 CRISPR-iScreen™ 技术平台，面向多种科研应用场景，构建了完善的表型筛选与数据分析体系，提供从实验设计到结果解析的精细化功能筛选服务，助力科研高效推进。无论是 CRISPR 文库质粒、CRISPR 文库病毒、CRISPR 文库 Cell Pool，还是 功能筛选体系搭建、NGS 测序，我们均可提供覆盖全流程的功能筛选与一站式 CRISPR 筛选服务，确保各环节无缝衔接，让科研更高效、更轻松。 源井生物即将推出全新文库自动分析平台，实现生信数据全自动化处理。科研人员无需依赖外部服务，轻松在实验室内自主完成CRISPR筛选数据分析与结果可视化，极大提升工作效率，节省人力和成本，真正做到数据“自己来”，科研更高效、更自由！ 参考文献 Chen, K.Y., Kibayashi, T., Giguelay, A. et al. Genome-wide CRISPR screen in human T cells reveals regulators of FOXP3. Nature 642, 191–200 (2025). |
回复此楼» 猜你喜欢
0856材料与化工，270求调剂
已经有14人回复
-
331求调剂
已经有3人回复
-
一志愿郑州大学，学硕，物理化学， 333求调剂
已经有4人回复
-
成果系统访问量大，请15分钟后再尝试。由此给您造成的不便，敬请谅解。
已经有11人回复
-
0703化学 一志愿东北大学 279分求调剂
已经有3人回复
-
化学 0703求调剂 总分293 一志愿211
已经有7人回复
-
26超级电容器申博
已经有4人回复
-
中国科学技术大学材料与化工281求调剂，有科研和获奖经历
已经有10人回复
-
26申博
已经有5人回复
-
26申博-目前4篇SCI一作
已经有3人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
10