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CRISPR技术如何用于基因敲除？一文带你全面了解！
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在生命科学研究中，基因敲除（Gene Knockout）是一种常见而关键的基因编辑策略，能够精准关闭目标基因，从而解析其功能机制。随着CRISPR/Cas9技术的兴起，基因敲除变得更高效、灵活，并逐渐成为基础研究、药物靶点筛选及疾病模型构建的主流手段。本文将围绕基因敲除的基本概念、CRISPR KO的机制与优势、实验protocol以及在科研与产业中的广泛应用展开解析。 什么是基因敲除 （Gene Knockout）？ 基因敲除细胞是指在特定细胞中人为删除或失活某个基因，从而使该细胞不再表达该基因编码的蛋白质的细胞系。这种细胞系常用于研究该基因的功能，以及它在细胞生理、生化途径、疾病机制中的作用。 常用的方法如CRISPR-Cas9技术：利用Cas9核酸酶在目标基因处产生双链断裂，随后通过非同源末端连接（NHEJ）导致框移突变，使基因失活。传统基因敲除方法（如ZFN、TALEN）效率较低，且操作复杂，而近年来CRISPR/Cas9技术的兴起，为研究者提供了更为便捷、快速且高效的编辑方式。 CRISPR敲除的工作原理 CRISPR系统来源于细菌的免疫机制，利用Cas9核酸酶和向导RNA（sgRNA）识别并切割特定的DNA序列。当CRISPR/Cas9在目标位点造成DNA双链断裂（DSB）后，细胞通常通过非同源末端连接（NHEJ）修复此断裂过程，容易引入插入或缺失突变（Indel），从而导致编码序列移码或提前终止翻译，实现目标基因的功能丧失。 基因敲除的核心优势 使用CRISPR技术进行基因敲除，具有以下特点： 高效精准：sgRNA序列可定制，理论上可针对任意基因位点； 适用广泛：几乎适用于所有哺乳动物细胞系； 可扩展性强：支持单基因敲除、多基因共敲及文库高通量筛选； 成本更低，周期更短：对比传统方法，CRISPR KO操作流程简化、实验周期缩短。 基因敲除的实验Protocol概览 源井生物基于自主研发的CRISPR-U™ 基因敲除技术平台，为科研客户提供一站式KO服务。标准protocol包括以下步骤： 1.sgRNA设计与合成：使用自主算法进行高特异性靶点预测； 2.Cas9与sgRNA导入细胞：通过慢病毒、转染或电转等多种方式； 3.单克隆筛选与扩增：FACS或有限稀释法分离； 4.基因型验证：Sanger测序、T7E1分析等方式确认突变情况； 5.蛋白表达验证：WB验证敲除效率，确保表型相关性。 此外，源井生物提供包括现货5000+KO细胞、基因敲除细胞构建、KO Pool混合克隆细胞在内的多种产品形态，覆盖癌症、免疫、神经、干细胞等研究方向。 CRISPR基因敲除的应用场景 CRISPR基因敲除广泛应用于： 功能基因组学：解析基因功能，构建调控网络； 药物靶点筛选：通过文库筛选找出关键致病基因； 疾病模型构建：构建特定病理突变细胞模型（如肿瘤抑制基因敲除）； 免疫治疗研究：敲除PD-1、CTLA4等免疫检查点基因，提高CAR-T细胞功能； 再生医学：敲除限制性因子提升细胞分化或诱导效率。 总结 源井生物致力于为科研客户提供高效率、高纯度、高验证的基因敲除细胞产品与定制化服务。无论您是需要构建稳定KO细胞株、进行基因文库筛选，还是寻找疾病模型细胞，源井生物都可根据您的研究目标与预算，提供最合适的解决方案。 |
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