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HEI-OC1细胞培养和基因编辑小技巧
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HEI-OC1细胞是一种来源于小鼠耳蜗毛细胞的常用细胞模型，在听力相关的基础研究中应用广泛。过去几十年间，它逐渐成为探讨毛细胞功能及其病理机制的重要工具，尤其在耳毒性筛药、听力损伤机制解析及听觉保护策略的研究中发挥着显著作用。该细胞系具备多个实验优势，例如较强的增殖能力、稳定表达毛细胞标志蛋白，以及对转染操作的良好响应——这些特性使其在模拟内耳毛细胞生理状态方面具备较高的参考价值。 目前，HEI-OC1细胞广泛应用于耳科学研究、高通量药物筛选以及新型基因治疗策略的前期探索。对于从事听觉生物学研究的科研人员而言，它几乎已经是“标配”模型。本文将简要回顾其来源、特性及常见应用，帮助读者更好地理解这一细胞模型在现代听觉研究中的角色与价值。 细胞信息： 细胞名称：HEI-OC1（小鼠耳蜗毛细胞系） 细胞形态：上皮细胞样，贴壁细胞 细胞培养条件：90%DMEM+10%FBS 气相：空气，95%；二氧化碳，5% 温度：37℃ 换液频次：2-3天/次 传代比例：1:3-1:5 注意：该细胞对培养时的温度敏感，37℃是标准培养条件，当细胞生长条件处于33℃时，细胞会出现快速增值和去分化现象；当生长条件是39℃时，高温会抑制细胞增殖，同时诱导细胞出现分化现象 细胞生长正常图片：通常呈典型多边形上皮样形态，细胞边界清晰，呈现典型的铺路石样紧密排列，单层生长不重叠 细胞生长状态差图片：细胞形态会发生改变，细胞边缘模糊，胞质内颗粒增多，折光性变低 1.细胞复苏 1)准备：取7mL完全培养基于离心管中备用 2)解冻：将细胞从干冰里取出，用镊子夹住盖子放入 37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化，直至冰块融化至绿豆大小，停止水浴 3)离心：将解冻后的细胞悬液转移至离心管中，1100rpm条件下离心4分钟，弃去上清液 4)重悬与接种：用完全培养基重悬细胞，接种于合适大小的培养皿或培养瓶中 5)培养：将培养皿或培养瓶置于37℃培养箱中培养，24小时后观察细胞状态及贴壁情况 细胞传代（以T25瓶为例）： 1)当细胞汇合度达到70-80%时可进行传代，传代时在超净台内弃去培养瓶里的培养液，加入5mLPBS洗涤细胞1-2次 2)加入1mL胰酶，轻轻晃动瓶子并使胰酶完全浸过细胞，将培养瓶放入培养箱孵育 1-2分钟，待在显微镜下观察到大部分细胞变圆变亮，轻轻晃动培养瓶两侧有大部分细胞脱落时，立即终止消化 3)加入2倍胰酶体积即2mL完全培养基终止消化，然后转移至15mL离心管中 4)1100 rpm 室温离心 4 分钟，离心结束，弃去上清，加入完全培养基重悬细胞 5)细胞按照1:3-1:5比例传代，传代第二天观察细胞状态 细胞冻存： 1)收集细胞：按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中 2)离心：1100rpm条件下离心4分钟，去掉上清 3)重悬与冻存：用细胞冻存液重悬细胞，按每1mL冻存液含1×10^6个细胞/mL分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息 4)降温与储存：将冻存管置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜后转入液氮罐内保存 细胞培养注意事项： 1.培养基和血清：确保使用正确的基础培养基和加入适量血清，配好的完全培养基需4℃保存，建议2周内使用完毕 2.细胞培养环境：培养温度控制在37℃（严格恒定，±0.5℃ 波动）、湿度≥90%（培养箱内放置无菌水盘）、CO₂ 浓度：5% 3.传代时机:汇合度 70-80% 时传代（超过 90% 易自发分化），通常每2-3天传代一次 4.细胞传代操作：细胞传代时，注意消化时间和胰酶浓度，避免因消化时间过长或过短导致的细胞损伤 5.冻存备份：建议保留不同代次的冻存备份；该细胞系传代超过30代后可能出现特性改变，建议建立主细胞库和工作细胞库 HEI-OC1细胞转染时注意事项： 1.确保细胞状态良好，细胞处于对数生长期，此时细胞活性高，分裂旺盛，有利于转染效率的提升，细胞密度一般在70-80%之间 2.注意细胞消化时间，避免过度消化，对细胞造成伤害 3.实验过程中细胞要吹打成单细胞，避免细胞聚团 4.细胞进行实验时活率≥90% 5.对于转染试剂使用前需要充分混匀保证其均匀性 6.建议进行药筛预实验找到最佳药筛浓度，以便于转染后进行药筛 7.电转法： (1)电转时需控制好细胞量，电转后根据细胞量接种到合适的培养板里 (2)需保证电转后细胞贴壁率≥70% (3)需控制好实验时间，电转全程不宜过长 8.慢病毒法： (1)进行正式实验前可进行预实验找到最合适的MOI (2)感染病毒前细胞汇合度控制在30-40%之间，不可过高 (3)感染前添加助染剂Polybrene 9.脂质体法： (1)选择适合HEI-OC1细胞的脂质体转染试剂，通过预实验确定最佳转染条件 (2)转染前24h进行细胞铺板，转染前细胞汇合度控制在60-70% HEI-OC1铺单克隆实验注意事项： 1.确保铺克隆实验前细胞状态正常，使用对数生长期的细胞进行铺克隆，铺克隆前细胞汇合度建议控制在70%左右 2.提前预温所有试剂（培养基、胰酶、PBS） 3.铺克隆时细胞活率≥85% 4.可先进行预实验找到合适的铺克隆梯度，避免单克隆占比太低 5.细胞接种96孔板时需确保细胞分布均匀 6.使用“有限稀释法”进行铺克隆，稀释细胞计数后结果最好落在1*10^6-2*10^6之间 |
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