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医学生物科研

铜虫 (小有名气)

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专业: 实验动物学

[交流] WB实验翻车现场？一文搞定常见问题+急救指南！已有1人参与

一、条带失踪案：无信号/条带模糊
可能原因：
样本问题：蛋白含量不足、降解或提取不当。
✅ 急救：BCA定量确认浓度；添加蛋白酶抑制剂；优化裂解液配方。
抗体失效：一抗/二抗浓度低、保存不当或反复冻融。
✅ 急救：提高抗体浓度（建议梯度测试）；更换新批次抗体；避免反复冻融（分装保存！）。
转膜失败：膜选择错误、转膜时间不足或气泡残留。
✅ 急救：大分子蛋白用0.45μm PVDF膜；延长转膜时间；滚轮赶尽气泡！
💡 小贴士：内参也失踪？先检查样本是否全部降解，或直接更换内参抗体（比如β-actin换成GAPDH）！
二、背景噪音大：膜上“繁星点点”
可能原因：
封闭不充分：封闭时间短、封闭剂浓度低或类型不匹配。
✅ 急救：延长封闭至1-2小时；提高脱脂奶粉/BSA浓度至5%；尝试不同封闭剂（如酪蛋白）。
抗体非特异性结合：一抗交叉反应或二抗浓度过高。
✅ 急救：降低一抗浓度；增加洗涤次数（TBST洗3×10分钟）；更换高特异性抗体。
膜污染：手套接触膜或试剂杂质残留。
✅ 急救：全程戴手套，镊子夹取膜边缘；过滤缓冲液！
⚠ 注意：若背景呈“斑块状”，可能是转膜时气泡未排尽，务必用玻璃棒滚压！
三、条带“变形记”：位置异常/拖尾
可能原因：
胶跑歪了：电泳电压过高、缓冲液离子浓度异常。
✅ 急救：降低电压（推荐80-100V跑浓缩胶，120V分离胶）；更换新鲜电泳缓冲液。
分子量偏差：蛋白修饰（磷酸化/糖基化）或二聚体形成。
✅ 急救：使用预染Marker对照；添加还原剂（如β-巯基乙醇）；尝试梯度胶优化分离。
“微笑”条带：胶凝固不均或电泳发热严重。
✅ 急救：确保灌胶均匀；电泳槽置于冰水中降温。
四、信号过曝：条带黑成一片
可能原因：
曝光时间过长：ECL试剂反应过度。
✅ 急救：缩短曝光时间（从10秒开始试）；稀释ECL工作液。
抗体浓度过高：一抗/二抗过量结合。
✅ 急救：降低抗体浓度；减少孵育时间（参考说明书减半测试）。
🔍 进阶操作：若目标条带与杂带分子量接近，可尝试调整凝胶浓度（如8%→10%）提高分辨率！
五、“神秘条带”：非目标蛋白现身
可能原因：
一抗特异性差：识别相似表位或存在多克隆交叉反应。
✅ 急救：更换单克隆抗体；查阅文献选择已验证抗体。
二抗非特异性结合：未完全去除的一抗残留引起。
✅ 急救：增加二抗孵育后的洗涤次数（推荐5×5分钟）。
🌟 终极方案：敲除/敲低细胞验证是否为非特异性条带！

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