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干货丨GL261细胞培养与基因编辑技巧指南
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作为一种源自 C57BL/6 小鼠的经典神经胶质瘤模型，GL261细胞因其具有明确的免疫原性，且可在免疫系统完整的小鼠中顺利建模，成为研究胶质母细胞瘤（GBM）免疫治疗的重要利器。无论是在解析 PD-1/PD-L1 通路机制、评估 CAR-T 或 NK 细胞的治疗潜力，还是在构建 CRISPR/Cas9 功能筛选体系中，GL261细胞都表现出卓越的适用性，是开展脑肿瘤免疫研究的理想模型。 本期内容将带你全面了解 GL261 的实验应用，从细胞培养的关键细节，到提升实验效率的实用策略，助你在神经肿瘤研究中取得更加稳健而高效的进展！ 细胞信息 细胞名称：GL261（小鼠胶质细胞瘤） 生长特性：贴壁生长 细胞形态：上皮样，贴壁细胞 细胞培养条件：90%DMEM+10%FBS； 气相：空气，95%；CO2，5%； 温度：37℃ 换液频次：2-3天换液一次 传代比例：1：2-1：3 细胞生长正常图片：细胞贴壁，轮廓清晰，细胞边缘整齐。培养过程中细胞间无大量碎片或者细胞分泌物。 细胞异常图片：少量贴壁细胞，细胞轮廓不够清晰。培养过程中有大量的细胞分泌物和细胞碎片。 细胞复苏 1) 准备工作：预热水浴锅至37℃，预热完全培养基，准备好细胞； 2) 在超净台内吸取 7 mL 已预热好的完全培养基至 15 mL 离心管中； 3) 将细胞从干冰里取出，用镊子夹住盖子放入 37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在 1 分钟左右完全融化； 4) 用单道移液器将细胞悬液转移至步骤2）提前准备好的15ml离心管中，盖上盖子，离心1100 rpm 室温 4 分钟； 5) 超净台内弃上清，吸取 1 mL 完全培养基重悬细胞至单细胞悬液，转移至装有 4 mL 完全培养基的 T25 cm2培养瓶 (或者 6cm 的皿) 中，写上细胞名称、复苏日期、 代次，放置 37℃、5% CO2培养箱中培养； 6) 第二天观察细胞状态。 细胞传代 1) 当细胞长至80%-90%汇合度即可传代。在超净台内把培养瓶里的培养液倒至废液缸，用1×PBS（T25 cm2培养瓶添加约2~3mL，T75 cm2培养瓶约4~5 mL）洗涤细胞1~2次，以去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）； 2) 加入相应体积的胰酶溶液，轻轻晃动瓶子并使胰酶完全浸过细胞，将培养瓶放入培养箱孵育1~2分钟，待在显微镜下观察到大部分细胞变圆不贴壁，轻轻晃动和敲击培养瓶两侧有大量细胞脱离时，立即终止消化； 表1 3) 加入2倍胰酶体积的完全培养液终止消化，并轻吹打细胞数次，使所有细胞彻底脱壁；注意：吹散细胞时注意要轻柔，尽量不产生气泡或尽可能产生少量气泡。 4) 用10 mL移液管转移细胞悬液到一支50 mL离心管中，同一批次的细胞可以合并收集在一起，视情况用适量 PBS将培养瓶里的残余细胞洗下来，一起加到50mL离心管中。盖上盖子，做好标记； 5) 1100 rpm室温离心4分钟，离心后，打开盖子弃上清，加2mL完全培养基重悬细胞； 6) 细胞按照一定的接种比例传代，首次按照1：2进行传代，若细胞在两天内长满可增加传代比例。 细胞冻存 1）将培养瓶里的细胞悬液全部转移至离心管中； 2）1100rpm离心4min，离心结束弃去上清，加入适量4℃预冷的冻存液重悬细胞，然后吸取20μL细胞悬液进行细胞计数，并调整细胞密度为5*10^6~1*10^7个细胞/mL； 3）按 1 mL/管分装至冻存管中，将冻存管放置于冻存盒中然后转移至-80℃冰箱； 4）过夜后，将冻存细胞转移至液氮罐内保存。 培养过程中细胞碎片、细胞分泌物过多或者药筛后死细胞过多 1) 若培养过程中死细胞过多，可以通过勤换液（隔天或者每天换液），且用优质的澳胎血清。 2) 若培养过程中细胞分泌物、细胞碎片过多；可以将细胞消化下来，终止消化后用PBS洗涤细胞团，重悬后将细胞悬液转移至1.5ml EP管中离心（1100rpm离心4min），离心结束尽可能的吸干净PBS，可重复此步骤两次，根据离心下来的细胞量接种至合适的培养容器中。 冻存复苏活率低（存活率低） GL261细胞容易受到冻存的影响，为了提高复苏时细胞存活率需要在冻存时加大冻存密度，一般建议冻存时细胞密度为1*10^6-2*10^6。在复苏时可先把细胞复苏至1-2个6孔，待细胞恢复状态后再转移至更大表面积的培养瓶中培养。 如何提高单克隆形成率 1. 铺克隆时细胞活率需要＞90% 2. 稀释细胞计数后结果最好落在1*10^6-2*10^6之间 3. 铺克隆时建议使用优质澳洲胎牛血清 4. 铺克隆时建议用PBS清洗细胞团两次 5. 可先进行预实验找到合适的铺克隆梯度，避免单克隆占比太低 6. 细胞接种96孔板时需确保细胞分布均匀 细胞转染时注意事项 1. 细胞活率＞90%，细胞状态正常，细胞轮廓清晰，细胞边缘整齐。 2. 转染过程中操作需轻柔 3. 选择电穿孔法进行实验时需选择合适的电转参数，避免参数不合适导致转染后大量细胞死亡 4. 病毒感染法进行正式实验前建议进行预实验找到最适MOI及最佳药筛浓度；确保感染的病毒滴度达标；感染前添加助染剂Polybrene；感染时建议12孔板内进行。 注意事项 1. GL261细胞在冻存时细胞活率建议大于90%，每管冻存细胞量控制在5*10^6-1*10^7/ml 2. GL261细胞在生长过程中会有细胞分泌物和细胞碎片产生，建议每隔一代传代的时候，用PBS洗涤细胞团，以减少细胞分泌物和细胞碎片对细胞增值、细胞状态的影响。 3. GL261细胞有密度依赖，传代比例不宜过大，建议是1：2-1：3。 4. GL261细胞对机械力较敏感。正常培养时，可轻柔吹打细胞，尽量避免吹打力度过大而导致细胞分化和造成细胞死亡 5. 培养时控制好细胞密度，培养、传代时让细胞处于一个合适的密度范围 6. GL261细胞对胎牛血清质量比较敏感，建议使用优质澳洲胎牛血清 |
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