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津渡津渡的生科

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[交流] 细胞蛋白如何提取，简化版步骤来了（附注意事项和闭坑指南）

一、细胞蛋白提取全流程

1. 实验前准备
- 裂解液：RIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制剂+1%磷酸酶抑制剂，现用现配）；
- 预冷设备：离心机（4℃）、冰盒、预冷PBS、冻存管；
- 耗材：细胞刮刀（或胰酶消化法）、200μL/1.5mL EP管。

2.操作步骤
- A [弃培养基] --> B [预冷PBS洗2次]；
- B --> C [加入裂解液 <br>（6孔板：每孔100μL）] ；
- C --> D [冰上裂解30min <br> 每10min涡旋震荡15s]；
- D --> E [4℃12000g 离心15min]；
- E --> F [吸取上清至新EP管]；
- F --> G [-80℃分装保存]。

二、致命失误闭坑指南

- 裂解液用量：细胞铺满80%的6孔板 → 100μL/孔（过多导致蛋白稀释，过少裂解不充分）；
- 抑制剂失效：蛋白酶抑制剂需-20℃避光保存，解冻后24h内用完；
- 离心温度：必须预冷离心机至4℃，否则蛋白降解。

三、关键注意事项
- 抑制降解：全程在冰上操作（裂解液接触细胞前必须预冷）；
- 避免泡沫：涡旋震荡时勿产生气泡（导致蛋白变性）；
- 核酸污染：高粘度样本需加DNase/RNase（否则WB条带拖尾）。

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1楼 2025-07-01 17:55:32

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