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构建 CRISPR 敲除细胞系时要注意哪些步骤
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构建CRISPR 敲除细胞系是一个包含多个关键环节的系统性工程。为了确保实验的高效性与可靠性，每一个步骤都需要严格把控、精准执行。随着 CRISPR 基因敲除技术在抗体验证、功能基因组学、药物靶点筛选等领域的广泛应用，越来越多科研人员开始尝试在本实验室内自主构建稳定的敲除细胞系，并不断优化流程以提高成功率。 在标准流程中，CRISPR 敲除细胞系的构建每一步都存在需特别注意的要点： 1. 项目设计与目标确认 明确敲除目的：根据功能研究需求确定是否需敲除整基因、关键外显子或大片段区域。如要提高敲除成功率，可考虑双gRNA策略，实现片段缺失。 靶点选择：优先选取功能关键外显子，并使用多种算法进行离靶评估，尽量降低脱靶风险。 2. gRNA设计与构建 多位点设计：推荐设计至少两条靶向同一目标的gRNA，或用于片段敲除的双gRNA，提升 KO 的效率与稳定性。 序列优化：gRNA序列需符合 PAM 要求（如 NGG），并结合 GC 含量、二级结构等进行优化。 3. 载体构建或 RNP 组装 表达模式选择： 质粒载体转染：如常用 pX330/pX459 系统，可搭载 Cas9 + gRNA；适合效率较高的银脂或脂质体转染。 RNP 形式转染：将 Cas9 蛋白和合成 gRNA 预组装，减少脱靶，提高敲除效率，适合不喜欢质粒残留的应用。 病毒载体转导：适用于难转染细胞系，如iPS/ES，会根据不同细胞特点选择病毒或电转等方式。 4. 转染与细胞处理 转染方法：依据细胞类型选择电转/脂质体/病毒三种方式之一。源井 CRISPRU™ 表明，针对300多种细胞类型都实施过参数优化。 增强编辑： 使用 Lipofectamine 3000、Neon 电转设备等提高转染效率。 为减少压力，可选择瞬时转染方式，更快获取编辑结果。 筛选策略： 如使用带有抗性座标的载体（如 pX459 含嘌呤霉素抗性），可在转染后进行药筛提升敲除率。 同时可结合荧光标记，用 FACS 富集阳性细胞。 5. 单克隆分离 限稀稀释法：将转染后的细胞稀释至单细胞接种到96孔板或使用FACS分选，生成单克隆。 克隆培养：细胞生成小群后逐步扩增，注意恒温、无污染及代数记录。 6. 筛选与验证 基因水平验证： 使用 PCR 扩增靶基因区域，结合 Sanger 测序或 TIDE／ICE 分析，判断 INDEL 型及敲除类型（单等位、双等位）。 检查片段缺失或拼接区间是否如预期发生。 蛋白水平验证： 通过Western blot、免疫荧光或 ELISA 等方法，确认蛋白表达消失。 7. 功能评估与应用 敲除细胞系可用于功能验证，如细胞增殖、迁移、凋亡检测、细胞周期分析等。 若仅单基因敲除未满足需求，可进行多基因联合敲除。 8. 数据分析与质量控制 编辑效率评估：在 CellPool层面进行测序评估，可将效率提高10–20倍。 脱靶评估：通过测序或其他手段监测潜在脱靶位点，保障结果特异性。 报告交付：源井提供含克隆鉴定结果、编辑率、脱靶筛查、Mycoplasma 检测等详细数据报告。 9. 时间与费用预估 根据源井实际经验，单基因 KO 细胞系最快可在1~4周交付。 服务模式为“未成功不收费”，降低客户风险。 源井 CRISPRU™ 平台在 gRNA 设计、转染优化、效率提升、验证流程和数据服务等方面提供了系统化支持，有效提高基因敲除效率、可靠性和可重复性，助您节省在细胞构建和验证环节所需的数月时间，让您专注于数据分析与科研突破本身。 |
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