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夏末～易科

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专业: 实验动物学

[交流] 细胞凋亡实验

细胞凋亡实验
细胞凋亡实验
1?? 实验原理：Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸（PS）有高度亲和力。当细胞发生凋亡时，膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）外翻到膜表面，而与荧光染料FITC标记的Annexin V结合，可通过流式细胞仪或荧光显微镜进行检测
由于凋亡晚期或坏死细胞膜丧失完整性，而4,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(4,6-Diamidino-2-Phenylindole,DAPI)可与双链DNA特异性结合并产生强烈的荧光，与Annexin V搭配使用，可区分处于不同凋亡时期的细胞。
2??实验步骤：
以下均为贴壁细胞步骤：
注意避光
使用六孔板铺板，一般细胞数为1×10^5/孔（根据自身调整）
1.将培养板中的培养基收集到离心管中（因为悬液中还有细胞）
2.4℃预冷的PBS洗一次，收集PBS到离心管中（PBS中有细胞）
3.用500ul无EDTA的胰酶消化（EDTA会影响Annexin V与PS结合），用离心管内的培养基终止消化，收集至相应离心管中
4.离心后去上清（800rpm , 3min），PBS清洗一次，转移至2mlEP管（1.5ml容易戳到管底）
5.弃上清（可以残留50 ul上清，避免倒走细胞），用100ul试剂盒中的Annexin V buffer（10x稀释成1x）重悬，依次各加入2.5ul Annexin V和 DAPI染料，室温避光孵育15-20min。除样本管外，还需设置空白管、单染管。
后加DAPI染料，因其细胞毒性大，时间延长，PI染色会增加
空白管：阴性对照组细胞，不做任何药物处理，不加DAPI和Annexin V 染料，目的用于调节电压
单阳管：只加DAPI或者Annexin V 染料，目的在于调节补偿
样本管：依次加入DAPI和Annexin V 染料，在空白管和单阳管调节好电压补偿后，获得所需流式数据
6.加入300-400 ul 的1x Annexin V buffer，混匀样本，注意减少吹打，减少机械性损伤
7. 立即上机
3?? 呈现结果为正常细胞（Annexin V -/ PI -）、早期凋亡细胞（Annexin V +/PI -）、晚期凋亡和坏死细胞（Annexin V +/PI +），一般来说呈现Annexin V - / PI +的细胞为人为机械性损伤细胞
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1楼 2025-05-28 19:51:13

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