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膜蛋白表达、提取和纯化超全攻略
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膜蛋白实验是不是让你头秃？别怕，今天就来给你讲讲膜蛋白的表达、提取和纯化的那些事儿，超详细攻略，赶紧码住！ 膜蛋白表达：这几个小技巧超实用 1️⃣ 最小生长培养基，效果出乎意料 用不富细菌生长培养基。 2️⃣ 表达同源物，或许柳暗花明 表达不出来？试试来自其他物种或属的同源基因。一级序列的细微差异，可能大大提升蛋白稳定性，不仅利于表达，体外稳定性也更好。有时候，换个“亲戚”蛋白，实验就能顺利很多。 3️⃣ 可溶性标签，给蛋白加个“保护罩” 给目标蛋白加个可溶性标签，比如绿色荧光蛋白，不仅提高表达产量和稳定性，还能在实验全程用荧光检测，一举多得。 膜蛋白提取：选对方法很关键 1️⃣ 去污剂萃取，适合结构研究 去污剂是常用选择，但化学环境和细胞膜不同，可能破坏膜蛋白功能。不过，它形成的胶束小，适合X射线晶体学，能提供均匀样品，是结晶的前提。 2️⃣ 纳米圆盘和脂质聚合物，功能检测的“神器” 纳米圆盘和脂质聚合物能吞噬细胞膜的整个部分，保留天然脂质，适合功能检测。还能捕获膜蛋白的天然寡聚化状态，但复合物大小可能和部分实验不兼容。 3️⃣ 控制时间和温度，耐心很重要 不管用啥试剂提取，都要给足时间，过夜效果更好。别怕加热，20-30°C下热运动增加，萃取效率比4°C下高很多。耐心等待，蛋白提取更充分。 膜蛋白纯化：镍亲和层析的小心机 1️⃣ 松散树脂，物理混合促结合 镍亲和层析时，用松散填料，能和样品物理混合，促进结合。 稀释增溶剂（至少2倍），让蛋白有更多机会和色谱柱结合。 3️⃣ 调整亲和标签，换个位置试试 蛋白不结合？试试把亲和标签换到另一端，或者延长标签，从6×His增加到12×His。 4️⃣ 钴填充亲和填料，纯度更高回收率稍低 用钴填充镍亲和树脂，纯度能提高，但回收率会降低。 5️⃣ 体积排阻色谱，纯度提升有妙招 需要更高纯度？体积排阻色谱法可以，但增溶剂会增加样品质量，形状可能奇怪。 毕合生物提供服务内容：分子生物学、免疫, 重组蛋白及ELISA相关、活性小分子化合物、高端化学、材料化学、细胞资源库与培养相关、生命科学、天然产物 |
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