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wb实验应该注意什么？
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样品制备 ? 蛋白提取：根据样本类型选择合适的裂解液，保证充分裂解细胞或组织，同时加入蛋白酶抑制剂，防止蛋白降解。 ? 蛋白定量：精确测定蛋白浓度，使上样量一致，可采用BCA等方法。 凝胶电泳 ? 凝胶配制：根据目标蛋白分子量选择合适的凝胶浓度，确保凝胶均匀、无气泡，聚合时间要足够。 ? 上样：上样前将蛋白样品与上样缓冲液混合，加热变性。上样量要准确，避免产生边缘效应。 ? 电泳条件：选择合适的电压和时间，通常先恒压后恒流，注意电泳液的量和温度，防止过热导致蛋白条带变形。 转膜 ? 膜的选择：根据蛋白分子量和实验需求选择PVDF膜或硝酸纤维素膜，PVDF膜灵敏度高，硝酸纤维素膜结合力强。 ? 转膜条件：根据膜的类型和凝胶大小选择合适的转膜电流和时间，一般采用湿转法，转膜过程中保持低温，防止蛋白扩散。 ? 转膜检测：转膜后可使用丽春红染色检测转膜效果，确保蛋白成功转移到膜上。 免疫反应 ? 封闭：转膜后的膜用封闭液封闭，如5%的脱脂奶粉或BSA，防止非特异性结合。 ? 一抗孵育：选择特异性高、亲和力强的一抗，按照说明书要求稀释，在合适的温度和时间下孵育，一般4℃过夜或室温孵育1 - 2小时。 ? 二抗孵育：根据一抗的来源选择相应的二抗，二抗要与一抗匹配，孵育温度和时间要适当，一般室温孵育1小时左右。 显色与结果分析 ? 显色方法：根据标记的二抗选择合适的显色方法，如化学发光法、DAB显色法等。化学发光法灵敏度高，DAB显色法结果易于保存。 ? 结果分析：使用成像系统采集图像，分析蛋白条带的位置、强度等信息，可使用相关软件进行灰度值分析，比较不同样品中目标蛋白的表达量。 此外，实验过程中要注意保持实验器材的清洁，避免交叉污染，同时做好实验记录，包括试剂的配制、实验条件等，以便出现问题时能够及时排查。 发自小木虫IOS客户端 |
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