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heismeng

金虫 (小有名气)

[交流] 得到的his蛋白不上柱子

我用大肠菌表达了一个C末端带6*His的蛋白质
超声得到了soluble fraction 经过了western blotting的验证是我的目的蛋白并且带有his
使用natural的蛋白质没有变性,用了talon和invitrogen的resin 发现吸附量都很小
unbound的量比较大
是否有人遇到这种情况?怎么解决呢 我现在用的binding buffer ph8 不含imidazole binding 4度1小时
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黑罕

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
很正常啊
HIS tag被包在蛋白内了,挂不上柱子啊
不是经常碰到,但也是有碰到的
重新设计,一切从头开始
2楼2009-11-05 21:25:48
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
重新设计克隆方案,试试N端。或者在his-tag前插入多几个亲水的aa,总之多试。也可以试试其他tag。比方说flag-tag,不过提纯成本高些,但是效果很好。
3楼2009-11-06 07:57:15
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biogate21

铁虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
拿弱的变性剂比如DOC试试,可能破坏多聚体,这样就能挂上柱子了
4楼2009-11-06 09:26:39
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heismeng

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by biogate21 at 2009-11-6 09:26:
拿弱的变性剂比如DOC试试,可能破坏多聚体,这样就能挂上柱子了

恩 可能确实是二聚体的问题
但是我最后要得到有生物活性的蛋白质
如果有DOC的话 会破坏活性吗
5楼2009-11-11 09:40:10
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heismeng

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by xuweitao at 2009-11-6 07:57:
重新设计克隆方案,试试N端。或者在his-tag前插入多几个亲水的aa,总之多试。也可以试试其他tag。比方说flag-tag,不过提纯成本高些,但是效果很好。

其实N端也有。。
FLAG我也加了 但是我要得到大量的蛋白质
不到万不得已肯定不会用免疫沉降的 太贵
6楼2009-11-11 10:43:38
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