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2025dream

新虫 (小有名气)

[交流] 蛋白纯化仪使用经验交流——大家遇到这些问题了吗? 已有3人参与

最近实验室的蛋白纯化仪频繁出现流速不稳定的问题,尤其是纯化包涵体时,柱子动不动就堵住,缓冲液换了几种还是效果不好……想和大家讨论几个常见痛点:  
1. 低浓度蛋白回收率低 目标蛋白浓度<1mg/mL时,洗脱峰总是不理想,试过调整上样量和结合时间,但收率还是上不去,有没有优化建议?  
2. 非特异性结合严重 特别是粗提液中杂蛋白多的时候,镍柱/离子柱的背景吸附明显,大家一般怎么预处理样品?  
3. 仪器维护成本 配件(比如泵密封圈、UV灯)更换频率比预期高,有没有延长使用寿命的小技巧?  

PS:最近试了梯度洗脱延长至5CV,杂带少了些,但时间成本翻倍了……)
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liyan1994

铁虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
调整你的柱子大小,尽可能上样时间短,包涵体你是柱上复性的?尿素浓度太高对柱子有影响,缓冲液有没有过滤?

镍柱纯化非特异性结合严重,可以在平衡液中加低浓度咪唑;

预实验一般先线性洗脱,确定好样品出来的洗脱液浓度以后就可以梯度洗脱了,你的梯度洗脱5CV是啥意思?
2楼2025-04-15 14:47:48
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科研检测交流

金虫 (正式写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
这个问题有意思,我都是直接群里问老师
蛋白纯化仪使用经验交流——大家遇到这些问题了吗?

3楼2025-08-17 17:56:03
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heylixing

铁虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
实话实说,我不太愿意,在AKTA上用高浓度的盐酸胍和尿素溶液。

包涵体蛋白变性条件下,我都是用蠕动泵上样和纯化。

顺便提一点建议,样品的澄清过滤很重要,动不动堵柱子总让人想到澄清过滤做的不够。澄清过滤也是下游的一项重要工作。
4楼2025-09-03 08:33:16
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