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[交流]
关于绿色荧光蛋白载体的一些问题
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问题：绿色荧光蛋白载体EGFP单独转染293T细胞是会不会出现绿色荧光？ 如果我在EGFP载体上插入一段序列，就是根据转染后有无荧光来确定这段序列是否表达了嘛？ 我再构建针对插入序列的RNAi载体，然后共同转染293T细胞，能不能根据转染后荧光亮度确定干扰载体的效率啊？       |
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2楼2009-11-03 20:33:52
gyesang
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| 楼主说的这个载体貌似IRES载体，就是真核多蛋白表达载体，像原核生物多顺反子转录那样，但要在你的序列和EGFP之间插入一段IRES序列，你说的第三种RNA干扰的情况，我想是可行的，你用你插入序列构建RNAi载体，转入细胞后合成双链的你的插入序列，然后被切成小的21-24个小双链RNA，在dicer等酶的引导下降解转录的你的插入序列，这一步你的序列被降解了，但下游的EGFP本身上游带IRES，表面上看其编码序列没受影响可以继续合成EGFP，其实不然，其实下游的跟你插入的序列一起转录的EGFP序列也会干扰掉，是因为你插入的序列被切成21-24个nt序列后，与转录的产物(该产物有你插入序列和EGFP的长mRNA序列)结合，在RdRP(RNA dependent RNA polymerase)作用下进行amplification，所谓的spreading，合成EGFP的干扰双链RNAi，从而降解掉EGFP编码序列，这其中涉及的RNA干扰，建议你去看一下RNA干扰的机制，必备的知识，现在不是microRNA很热吗 |
3楼2009-11-03 21:03:59