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EPRUIbiotech新虫 (初入文坛)
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[交流]
链霉亲和素磁珠在使用过程中的问题及对应方法整理 已有2人参与
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1.链霉亲和素磁珠在使用磁力架时无法沉淀，如何解决？ 可能样品溶液粘度过高或者由于蛋白-蛋白相互作用，磁珠形成了聚集体。解决办法：1.延长分离时间（将管子放在磁力架上2-5分钟）。2.裂解物加入DNase酶（0.01mg/ml）。3.将Tween 20浓度提高至结合和/或者0.05%洗涤缓冲液。4.向结合缓冲液和或洗涤缓冲液加入20mMβ-巯基乙醇。 2.链酶亲和素是否会从链酶亲和素磁珠中脱落？ 链霉亲和素分子与磁珠表面共价结合；在正常的推荐条件下，脱落可忽略不计 (37℃下，链霉亲和素分子总量不到0.2%)。然而，应该注意的是，并非所有的四个链霉亲和素亚单元都与磁珠是共价偶联的。通常，一个或两个亚单元共价偶联。链霉亲和素与其它蛋白类似，如果加热会变性并解聚为亚基。如果链霉亲和素偶联的磁珠被煮过，一些链霉亲和素亚基可能会从磁珠上释放出来（以单体或者聚合物形式）。共价偶联的链霉亲和素亚基不受这种处理的影响。当链霉亲和素与生物素偶联时，链霉亲和素—生物素复合物比单独的链霉亲和素更加稳定。 3.如果链酶亲和素磁珠被意外冷冻了是否还能使用？ 仍然可以使用，为了在实验室内测试低温下的稳定性，将链霉亲和素磁珠在 -20 ℃下放置 24 小时，然后将其转移到室温 (15-25℃) 下72 小时。 此冻融循环重复 4 次，并将磁珠在 2-8℃条件下储存 60 个月。然后检测了生物素结合能力，并发现其符合质量标准要求。 4.如何优化链霉亲和素磁珠偶联的磁珠结合能力？ 链霉亲和素偶联的磁珠的结合能力具有片段长度依赖性。对大分子DNA 或 RNA 片段结合能力的下降可能是由于空间位阻所致。以下是一些优化结合能力的建议。 盐浓度会影响生物素化核酸与链霉亲和素磁珠的结合效率。生物素化DNA片段 (长达 1 kb) 的较优结合条件是在1 M NaCl (最终浓度) ，5°C和孵育15分钟下实现的。更长的DNA片段应固定过夜。生物素化抗体应在 pH 7.4 的PBS 缓冲液中固定，并添加 0.1% 的 BSA。 请确保样品中没有过量的游离生物素，因为游离生物素会比较大的生物素化分子更快地结合链霉亲和素磁珠。生物素化寡核苷酸应通过反相 HPLC 或 FPLC 进行回收，以去除样品中的游离生物素。 我们还建议根据每个特定应用的需要进行滴定实验，以优化使用的磁珠数量，因为特定分子的大小和生物素化过程都会影响磁珠的结合能力。 5.使用的链霉亲和素磁珠出现了核酸的非特异性结合问题。我能做些什么来减少此种情况？ 保持高 pH 值和低盐浓度，这将有助于保持核酸和磁珠上的负电荷。 6.使用链酶亲和素磁珠得到了高背景，如何防止这种情况发生？ 背景可能是由于磁珠表面与 BSA 的非特异性结合所致，或者高背景可能是由于与链霉亲和素的非特异性结合引起的。增加 pH 值或盐浓度可能有助于减少结合。 7.如果链酶亲和素磁珠聚集，应该怎么办？ 链霉亲和素磁珠具有带负电荷的表面，磁珠的表面电荷可能会导致一些样品中的磁珠浮在液面上，或变得粘稠或聚集。粘性可能是由于磁珠之间或磁珠与管壁之间的静电相互作用造成的。通常，我们建议在进行实验之前，用诸如 Tween 20 去污剂的非离子去污剂洗涤磁珠。通常只需将 Tween 20 去污剂加入到磁珠中，最终浓度可达到0.1%，然后在不含去污剂的缓冲液中重悬并洗涤磁珠，就可以减少或消除这个问题。可能需要在 Tween 20 溶液中孵育，例如在室温下滚动孵育 5-10 分钟。此外，我们建议使用硅化管。这种处理很可能降低磁珠的静电电势。 8.在使用链霉亲和磁珠进行mRNA分离后出现DNA污染的情况，为什么会这样？ 有以下几种原有：1.DNA 剪切不完整。 2.杂交步骤后未完全去除样品裂解物。 3.洗涤不充分和/或未完全去除洗涤缓冲液。 4.样品与磁珠的比率过高。 |
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