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落明逐暗金虫 (正式写手)
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BCA和Lowry法测定铜离子亲和层析液的值差很大
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| 我最近测铜离子亲和层析液时，BCA测出来是0.298mg/ml，Lowry是1.008mg/ml，虽然别的测定值也有差异但都较小，这个相差太多，想请教各位前辈是怎么回事。所用洗脱液为50mM甘氨酸+0.3M氯化钠，pH3.0，洗脱的是干扰素。 |
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HarveyWang
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BCA蛋白质定量检测 点击次数：418 作者：lsk 发表于：2008-07-21 17:59 转载请注明来自丁香园 来源：互联网 http://www.fastagen.com/article/view.asp?id=215 主要特点： · 准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是20－2000μg/ml,采用加强方法可检测到5μg/ml；MicroBCA试剂测定范围是0.5-20μg/ml。 · 快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便。 · 经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量。 · 不受样品中离子型和非离子型去污剂影响。 · 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考玛斯亮蓝。 基本原理： 碱性条件下，蛋白将Cu++还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 可进行100次常规测定，500次微量测定。常温运输，室温保存，有效期12个月。 操作方法： 1) 蛋白标准品作系列浓度稀释，浓度范围可设定在25μg~2500 μg/ml，或涵盖样品估计浓度的一定范围。稀释液可用生理盐水、PBS或0.1% SDS。测定样品也可作2~3个稀释浓度。用稀释液作空白对照。 2) 根据测定数量的不同，按50/1比例混合A液和B液，配制成工作液。混合时，液体可能出现浑浊，混匀后则形成清亮浅绿色溶液。 3) 微量测定法： l 96孔板各孔中加入20 μLl不同浓度的蛋白标准品和待测样品，以及空白对照。每孔加入200 μL工作液。置37℃放置30 min。 l 在酶标仪上测定562 nm波长（或540~595 nm波长）下的吸光度。 l 根据蛋白标准品浓度和吸光度，制作蛋白浓度标准曲线。从标准曲线和样品稀释倍数计算样品的蛋白浓度。 4) 常规测定法： l 标记一系列试管，每管中加入100 μL不同浓度的蛋白标准品和待测样品，以及空白对照。每管加入1 ml工作液。置37℃放置30 min。 l 在分光光度计上测定562 nm波长（或540~595 nm波长）下的吸光度。 l 根据蛋白标准品浓度和吸光度，制作蛋白浓度标准曲线。从标准曲线和样品稀释倍数计算样品的蛋白浓度。 BCA分子式  原理：   BCA蛋白质检测流程：   讨论： （1）从本质上说， BCABCA(bicinchoninic acid) 测定的是BCA对溶液中Cu+络合能力。不是某蛋白分子含量的真实大小。除非你用此很纯的蛋白分子 称量后作标准蛋白曲线。 而Cu+是在碱性溶液中由蛋白分子或其他还原剂还原 Cu2+生成的。 BCA蛋白浓度测定的干扰因素：BCA蛋白浓度测定的显色反应依赖于Cu离子的还原。还原剂如DTT、巯基乙醇，以及离子络合剂如EDTA、EGTA，均可干扰成色反应。 Lowry 测定的是蛋白分子中Try等少数几个氨基酸的侧链基团 参与某种氧化还原反应的能力。故而单纯的Try 氨基酸也可以反映出吸光值，而Gly 则不能。 所以，举一个极端的离子，有Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-（Gly-Gly-）n-Gly-Gly，蛋白分子用Lowry法测定时，其测定值肯定远远小于其真实含量。 干扰素中的氨基酸比例同标准蛋白BSA或 HSA不同，测定误差加大。 但是，用来测定生物体破碎液全蛋白（很多很多种类的蛋白啊！！！！）则误差要小很多。 但是，也要注意，测定的蛋白质量浓度时 BSA表示的！！！ 不是所测蛋白的真实质量浓度！！！！ （2）测定过程影响因素 BCA测定不受缓冲液中微量的杂质干扰，但其中你没有注意的因素影响却很大！！！ 例如：溶液中微量的Cu2+等在1uM 浓度变化时可以影响其最终读数A。 缓冲液中有其他竞争性螯合Cu+或Cu2+的分子， 读数时的光度计内的温度若跟你标线的温度差5℃，就明显影响其重复性！ Lowry 测定其实涉及到电子转移，是个氧化还原过程，故而测试样品中1uM的巯基乙醇或DTT都可以读出很高的吸光值，即使没有蛋白分子。 [ Last edited by HarveyWang on 2009-11-4 at 15:31 ] |
2楼2009-11-04 12:27:36
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