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蛋白质浓度测定UV法、BCA法、考马斯亮蓝法3种常用方法比较 已有3人参与
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测定蛋白质浓度的方法有很多，科研工作者广泛使用的方法比如紫外吸收法，双缩脲法，BCA方法，Lowry法，考马斯亮蓝法，凯氏定氮法等等，今天酶联生物以UV法，BCA法，考马斯亮蓝法，其中的三种方法的测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项做详细介绍。 UV法 这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。 1.简易经验公式 蛋白质浓度(mg/ml)=[1.45*OD280-0.74*OD260]*Dilutionfactor 2.精确计算 通过计算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通过如下公式计算最终结果： ①、蛋白质浓度(mg/ml)=F*(1/d)*OD280*D ②、其中d为测定OD值比色杯的厚度 ③、D为溶液的稀释倍数 BCA法 原理：BCA（bicinchoninincacid）与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，工作试剂由原来的苹果绿色变为紫色复合物。562nm下其光吸收强度与蛋白质浓度成正比。 考马斯亮蓝法 实验原理：考马斯亮蓝(CoomassieBrilliantBlue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量测定微量蛋白浓度快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。目前，这一方法是也灵敏度最高的蛋白质测定法之一。 考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 突出优点 （1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和需要严格地控制时间。 （3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 缺点 （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。 希望上述3种方法祝您在蛋白质浓度测定中有所帮助，大家可以结合对比选择适合自己的蛋白质浓度测定方法。还有疑问，欢迎留言交流！  |
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