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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 反向PCR
汕头大学海洋科学接受调剂
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sunjiali2005

银虫 (小有名气)

[交流] 反向PCR

反向PCR可以鉴定转基因植株的拷贝数，我想请教的问题是：用反向PCR鉴定植株的拷贝数需要什么条件要求，内切酶的选择及引物设计是否要靠近T-DNA边界？

[ Last edited by amisking on 2009-11-1 at 11:26 ]
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孙家利
1楼 2009-11-01 11:16:44
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sunjiali2005

银虫 (小有名气)
谢谢！
我不扩增旁侧序列，我的目的是确定拷贝数，选取低拷贝的转基因植株做RT-PCR。然后是蛋白的测定，在之后纯和植株，Tail-PCR调去旁侧序列，作为转基因植株的特异性检测。
我也有两株突变体，主要是生殖器官的变异，旁侧序列已调取，我以前没做过突变体，请问下面该怎么做？
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孙家利
5楼2009-11-02 19:26:24
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gyesang

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amisking(金币+2,VIP+0): 11-2 11:58
为什么要用反向PCR来鉴定转基因拷贝数呢，为什么不做southern blot来鉴定呢，反向PCR一般是用来克隆T-DNA侧翼序列的，光想知道拷贝数的话，用不着做iPCR，iPCR有时候并不是想象的那么顺利
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2楼2009-11-01 21:00:36
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sunjiali2005

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by gyesang at 2009/11/1 21:00:
为什么要用反向PCR来鉴定转基因拷贝数呢，为什么不做southern blot来鉴定呢，反向PCR一般是用来克隆T-DNA侧翼序列的，光想知道拷贝数的话，用不着做iPCR，iPCR有时候并不是想象的那么顺利

转基因植物拷贝数对转基因的稳定性和转基因沉默有很大关系,所以要做拷贝数实验,我见有资料说可以通过Ipcr或者荧光定量PCR鉴定植物的拷贝数,southern blot做起来不是太慢了吗,而且要比Ipcr贵好多.
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孙家利
3楼2009-11-02 11:39:30
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gyesang

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转基因植物拷贝数对转基因的稳定性和转基因沉默有很大关系,所以要做拷贝数实验,我见有资料说可以通过Ipcr或者荧光定量PCR鉴定植物的拷贝数,southern blot做起来不是太慢了吗,而且要比Ipcr贵好多. [/quote]
这样啊，我做转基因水稻比较多，我告诉你我是怎么做的，把目的基因构建到转基因载体上，我是过表达的，ubiquitin 或者35S promoter，然后转化水稻callus，长出苗后种在地里，一方面做southern blot看看有没有转进去(当然跑PCR鉴定就足够了，我做southern是因为我这里做southern比较方便，而且可以直接看出插入拷贝数，如果你做iPCR的话，你不会搞清楚到底有多少个拷贝，我们有突变体库，有时想克隆突变体的侧翼序列，得先做southern blot看有多少个插入，我几乎可以肯定的说想通过iPCR的方法来鉴定拷贝数是不可能的，因为我有过这样的经验，我筛选到一个突变体，想克隆基因，做southern后，举例有3个拷贝，然后开始克隆，但就是总克隆不到3个侧翼序列，所以iPCR不是想象那样的能克隆出所有插入的T-DNA的侧翼序列，当然如果你肯花足够的精力和时间，我相信总有一天你会把它克隆全，这里我是知道是三个的，如果我不做southern，我总克隆到两个，那还以为就是两个拷贝呢，其实不然，是三个拷贝)，是的有时候你有目地基因插入不一定就会被过表达了，正如你所说的，什么基因沉默（转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing and transgene silencing)），所以这时候你得提RNA做northern blot，看看表达量上升了没有，光克隆到侧翼序列，还是不知道是否被沉默，再说被沉默的那种情况不是由于侧翼序列引起的，而是由于过表达的序列形成双链RNA分子从而引发RNA干扰。所以从而言之，通过southern确定插入拷贝数，通过northern或者半定量PCR(足够了，real timePCR有钱做吧)确定表达量。

[ Last edited by gyesang on 2009-11-2 at 18:20 ]
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4楼2009-11-02 16:49:50
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