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Abbkine亚科因

新虫 (初入文坛)

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[交流] Caspase-2活性分析试剂盒（比色法）实验操作步骤已有1人参与

原理
半胱氨酸蛋白酶的Caspase家族已显示在凋亡中起关键作用。哺乳动物Caspase可分为三个功能组：启动子半胱天冬酶（Caspase-2、8、9和10），执行者半胱天冬酶（Caspase-3、6和7）和炎性半胱天冬酶（Caspase-1、4、5、11 和 12）。Caspase-2属于半胱氨酸蛋白酶家族，其仅在天冬氨酸残基后的氨基酸切割蛋白质。在这个家族中，Caspase-2是Ich-1亚家族的一部分，它是不同动物物种中最保守的胱天蛋白酶之一。它具有与启动子半胱天冬酶类似的氨基酸序列，包括Caspase-1，Caspase-4，Caspase-5 和Caspase-9。它是作为酶原产生的，它包含一个与Caspase-9相似的长前结构域，并含有一个蛋白质相互作用域的CARD结构域。 Caspase-2前体（Pro-Caspase-2）包含两个亚基，p19 和 p12。Caspase-2活性分析试剂盒（比色法）基于Caspase-2 水解肽底物 Ac-VDQQD-pNA（乙酰基- Val-Asp-Gln-Gln-Asp对硝基苯胺），产生黄色的对硝基苯胺（pNA），pNA在405 nm附近有强吸收,从而可以通过测定吸光度来检测Caspase -2的活性。
自备耗材
·酶标仪（能测405 nm处的吸光度）
·96孔板
·低温离心机、制冰机
·可调节式移液枪及枪头
·去离子水、磷酸盐缓冲液 (PBS)
·匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
Working Cell Lysis Buffer: 使用前，立即加入DTT（最终浓度：每1 mL Cell Lysis Buffer加10 µL DTT（100×）），置于冰上；4℃保存。
Working Reaction Buffer (1×): 使用前，用去离子水稀释到Reaction Buffer (1×)，再加入DTT（最终浓度：每1 mL Reaction Buffer (1×)加10 µL DTT（100×）），置于冰上；4℃保存。
Ac-VDQQD-pNA (4 mM): 即用型；使用前，置于冰上；–20℃保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存，避免反复冻融。
pNA(10 mM): 即用型；使用前，置于冰上；–20℃避光保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存，避免反复冻融。
DTT(100×): 即用型；使用前，置于冰上；–20℃保存。用不完的试剂-20℃分装保存，避免反复冻融。
Standard设置：用Reaction Buffer (1×，含DTT)将标准品pNA (10 mM)稀释为200、100、50、20、10、0 µM的标准溶液。
样本制备
注意：我们建议使用新鲜样品。或按照“样本制备”将样品保存在-80℃。使用前，在冰上解冻，这可能会影响样品的稳定性，并且读数可能会低于预期。此试剂盒可检测蛋白水解活性。在样品制备步骤中请勿使用蛋白酶抑制剂，它可能会干扰测定。
1. 通过所需方法诱导细胞凋亡。同时，建议对每个Caspase-2比色测定法设置不诱导的对照培养。
2. 对于贴壁细胞，胰蛋白酶消化收集细胞。600 g，4℃离心5 min，小心吸去上清液。用1 mL PBS洗涤细胞2次。离心后，去除上清液。在50 µL Working Cell Lysis Buffer中重悬1-5×106个细胞。
3. 对于悬浮细胞，600 g，4℃离心5 min，小心吸去上清液。用1 mL PBS洗涤细胞2次。离心后，去除上清液。在50 µL Working Cell Lysis Buffer中重悬1-5×106个细胞。
4. 对于组织，将5-20 mg组织切成小块，用PBS清洗组织，加入0.1 mL Working Cell Lysis Buffer，冰浴匀浆。
5. 裂解物冰上孵育15-20 min。
6. 16,000 g，4℃离心15 min，然后将上清液转移至新试管中，置冰上待测。
7. 立即测定Caspase-2的酶活性或-80℃保存样品。同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度。
注意：如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3002的蛋白质定量试剂盒（Bradford法）进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1.酶标仪预热30 min以上，调节波长到405 nm。
2.操作表（下述操作在96孔板中操作）：
空白孔（μL）标准孔（μL）测定孔（μL）
Working Reaction Buffer (1×，含DTT) 100 50 50
Standard 0 50 0
上清 0 0 50
Ac-VDQQD-pNA (4 mM) 5 5 5
3.混匀，37℃孵育1-2 h，检测405 nm处吸光值。空白孔记为A空，标准孔记为A标、测定孔记为A测。计算ΔA测=A测-A空，ΔA标=A标-A空。
注意：1.空白孔只需测定 1-2 次。实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验；2.在反应体系中，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡；3.发现颜色变化比较明显时即可测定405 nm的波长。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。
结果计算
注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。
1. 按标准曲线计算
以标准溶液浓度为x轴，ΔA标为y轴，绘制标准曲线y=kx+b。将样本的ΔA测带入方程得到x值（μM）。
2. 按酶活性增加百分比计算
Caspase-2活性增加百分比=(实验处理组A测定-A空白)/(实验对照组A测定-A空白)×100%
该方法简单可靠，可粗略反应酶活性情况。
3. 按酶活计算
参考 Chemicon公司的Caspase酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时,在37℃一个小时内可以剪切1 nmol pNA底物产生1 nmol游离pNA的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的Caspase酶活性。
Caspase-2活性（U/mg prot）=x×V反总÷(V样×Cpr)÷T×103=2.1×x÷Cpr÷T
V反总：反应体系总体积，0.105 mL=1.05×10-4 L；V样：加入的样本体积，0.05 mL；T：反应时间，h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；103：单位换算系数，1 μmol =103 nmol。
注意：对于样品中Caspase-2酶活力特别高的情况，须用Working Cell Lysis Buffer适当稀释样品后再进行测定。计算时再乘以稀释的稀释倍数n。

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