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细胞增殖/毒性检测试剂盒（CCK-8法）实验操作步骤
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原理 细胞增殖/毒性检测试剂盒（CCK-8法）是基于高度水溶性的四唑盐WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)来进行测定的。WST-8在电子介体的作用下可还原生成水溶性甲瓒产物，产生颜色反应。CCK-8是非放射性的，可在细胞增殖和细胞毒性实验中，对活细胞进行灵敏的比色测定，从而计算出细胞数量。WST-8被细胞中的脱氢酶还原而生成橙色产物（甲瓒），可溶于组织培养基中。细胞中脱氢酶产生的甲瓒产物的量与活细胞的数量成正比。CCK-8试剂盒检测灵敏度高于其他四唑盐（例如MTT，XTT，MTS或WST-1）。 自备耗材 ·酶标仪（能测 450 nm 处的吸光值）及二氧化碳培养箱（37℃，5% CO2） ·96孔细胞培养板，透明平底、可调节式移液枪及枪头 试剂准备 CCK-8溶液：即用型，无需预混合组分。 实验流程 细胞计数方案 1.在96孔板中接种细胞悬液（100 μL/孔），将板在潮湿的培养箱中预先培养（37℃，5% CO2）； 2.在平板的每个孔中加入10 μL CCK-8溶液，注意不要将气泡引入孔中，因为它们会干扰OD值读取； 3.在培养箱中将平板孵育1-4 h；时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定； 4.使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。 细胞增殖/毒性检测方案 1.在96孔板中接种100 μL细胞悬液（5,000个细胞/孔），将板在潮湿的培养箱中预培养24 h (37℃，5% CO2）； 2.在平板中加入1-10 μL各种浓度的待测物质； 3.在培养箱中将平板孵育适当的时间（例如6、12、24或48 h）； 4.向板的每个孔中加入10 μL CCK-8溶液，注意不要将气泡引入孔中，因为它们会干扰OD值读取； 5.在培养箱中将平板孵育1-4 h；时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定； 6.使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。 结果计算 细胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100% 抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100% As：实验孔吸光度（含细胞、培养基、CCK-8 溶液和药物溶液）； Ac：对照孔吸光度（含细胞、培养基、CCK-8 溶液，不含药物）； Ab：空白孔吸光度（含培养基、CCK-8 溶液，不含细胞、药物）。 注意事项 1.由于CCK-8分析基于活细胞中脱氢酶活性的检测，因此影响活细胞中脱氢酶活性的条件或化学物质可能会导致实际活细胞数与使用CCK-8分析确定的细胞数之间存在差异； 2.混合或重悬组分时，避免产生气泡，因为它们会影响OD值读取； 3.孵育时间因孔中细胞的类型和数量而异。通常，白细胞着色较弱，因此可能需要较长的孵育时间（最多4 h）或大量细胞（~105个细胞/孔）； 4.如果由于长期培养而改变了培养基的颜色或pH，请在添加CCK-8时更换培养基； 5.由于CCK-8的毒性低，因此相同的细胞可用于其他细胞分析。 6.一般情况下OD值范围在0.1-2.0都可以，在1.0附近比较好。一般可将对照孔吸光度（含细胞、培养基、CCK-8 溶液，不含药物）的OD值控制在0.8-1.0左右，确定细胞的检测数量和孵育时间。 |
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