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人 8 羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）定量检测试剂盒（ELISA）的原理与应用
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人 8 羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）定量检测试剂盒（ELISA）的原理与应用 摘要：本文详细介绍了人 8 羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）定量检测试剂盒（ELISA）的实验原理、试剂盒组分、样本采集与保存、检验方法、性能指标以及生物安全注意事项等内容，该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点，仅供科研使用。 一、引言 8-OHdG 是 DNA 氧化损伤的重要标志物之一，其含量的变化与多种疾病的发生发展密切相关。人 8 羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）定量检测试剂盒（ELISA）为科研人员提供了一种准确、快速检测血清、血浆、细胞培养上清液、组织中 8-OHdG 含量的方法，对于相关疾病的研究具有重要意义。 二、实验原理 试剂盒采用酶联免疫分析方法中的竞争抑制反应原理。首先，纯化的抗 8 羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）抗体包被微孔板，生物素标记 8 羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）作为检测抗原。在反应体系中，一定量的固相抗体与生物素标记的 8-OHdG 及非标记抗原（校准品或标本）进行竞争结合，当非标记抗原量多时，抗体与生物素标记的 8-OHdG 结合就少，反之结合就多。反应平衡后，形成固相抗体 - 生物素化 8 羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）- 酶标 - 亲合素复合物。经加底物显色后，用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值）。随着 8-OHdG 浓度的升高，OD 值逐渐下降呈良好的线性关系，通过标准曲线方程即可计算出样品中 8-OHdG 的含量。 三、试剂盒组分与保存 组分：试剂盒包含校准品 0.5ml / 管 * 6 管，其为抗原配制的 6 个浓度标准品，浓度依次为 48、24、12、6、3、0ng/mL；96T/48T 的预包被固相抗体的包被微孔板；6mL 的 HRP 标记的检测抗体；6mL 的检测抗原生物素化抗原；6mL 的过氧化脲工作液底物液 A 和 6mL 的 TMB 工作液底物液 B；6mL 的 2mol/L 稀释液终止液；6mL 的 PBS 样本稀释液；30mL 的含 0.15% Tween20 的 PBS 20× 浓缩洗涤液以及说明书、自封袋、不干胶等。 保存条件：未开封的试剂盒需保存在 2-8 度，不得使用过期试剂盒。 四、样本的采集和储存 采集方法： 细胞培养上清：在 4000rpm 条件下离心 20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在 20℃以下，避免反复冻融。 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4000rpm 条件下离心 20min，小心地分离出血清，保存在 - 20℃以下，避免反复冻融。 血浆：采用肝素，EDTA，或柠檬酸钠作为抗凝剂，在 4000rpm 条件下，离心 20 分钟取上清，血浆保存在 - 20℃以下，避免反复冻融。 组织：用预冷的 PBS (0.01 M,pH=7.4) 冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的 PBS 加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨，可进一步对匀浆液进行超声破碎或反复冻融，最后将匀浆液 5000×g 离心 5-10 分钟，取上清检测。 保存条件和稳定性：样本在 2-8℃条件下，可以储存 72h，或者在 - 20℃储存 6 个月。样本收集后，若不是一次检测完，应按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分解冻。 五、检验方法 试剂准备：将各种试剂移至室温平衡两小时，取浓缩洗涤液，根据当批检测数量，用蒸馏水 1：20 稀释，混匀后备用。 加样：将预包被板从密封袋中取出，设一个空白对照孔，不加任何液体；每个校准品设 2 孔，每孔加入对应校准品 50μl；其余每个检测孔直接加待测血清或质控品 50μl。除空白孔外所有孔加入生物素化抗原 50μl，混匀，贴上封板膜，置 37℃温育 60 分钟。 洗板：可采用手工洗板或洗板机洗板，均需重复 3 次后拍干。手工洗板时，弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置 10 秒甩干；洗板机洗板时，选择洗涤 3 次程序洗板后拍干。 显色与终止反应：每孔加入酶标亲合素 50μl（空白对照孔除外），混匀，贴上封板膜，置 37℃温育 30 分钟。之后每孔加显色剂 A 50μl，显色剂 B 50μl，振荡混匀后，置 37℃避光显色 15 分钟，每孔加终止液 50μl。 结果测定与计算：用酶标仪读数，取波长 450nm，先用空白对照孔调零点，然后测定各孔光密度值（OD 值）。以标准品浓度做为纵坐标，对应的吸光度（OD 值）作为横坐标，利用计算机软件，采用四参数 Logistic 曲线拟合（4-pl），创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD 值），利用方程计算样品的浓度值。若样品被稀释，需将测得的浓度值乘以稀释倍数，才是样品的最终浓度。 六、试剂盒性能指标 物理性能：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；所有组分应无包装破损，各组分装量不少于组分表中要求。 剂量反应曲线线性：用四参数 Logistic 曲线拟合（4-pl），剂量 - 反应曲线相关系数（r）的绝对值应不低于 0.9900。 精密度：批内精密度和批间精密度的变异系数 CV% 均小于 15%。 灵敏度：最低检出限应不高于 0.1ng/mL。 回收率：在 85%-115% 之间。 稳定性：在 2℃-8℃保存，有效期为 6 个月。 检测范围：为 3 ng/mL – 48 ng/mL。 七、生物安全注意事项 检测必须符合实验室管理规范的规定，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置。 试剂盒的液体组分中，含有 proclin-300 防腐剂，可能引起皮肤过敏反应，避免吸入烟雾与皮肤接触。 底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入烟雾。 实验人员应戴上防护手套，实验完成后彻底洗手。 八、结论 人 8 羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）定量检测试剂盒（ELISA）是一种性能优良的科研工具，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、操作简单、快速等特点，可准确检测多种样本中的 8-OHdG 含量，但需严格按照说明书操作，并注意生物安全防护，仅供科研使用，不得用于临床诊断。 |
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