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大鼠褪黑素（MT）定量检测试剂盒（ELISA）使用指南
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大鼠褪黑素（MT）定量检测试剂盒（ELISA）使用指南 大鼠褪黑素（MT）定量检测试剂盒（ELISA）专为科研工作者设计，用于定量检测血清、血浆、细胞培养上清液及组织中的大鼠褪黑素（MT）含量。在使用本试剂盒前，请务必仔细研读本说明书。 实验原理 本试剂盒采用竞争 ELISA 法。预先包被褪黑素（MT）抗体的微孔板中，依次加入样本 / 校准品和 Asaay Diluent，温育洗涤后，加入 SA - HRP 再次温育。经二次洗涤，加入底物 TMB 显色，室温反应后用终止液终止，通过读取 OD 值实现检测。OD 值与样品中褪黑素（MT）含量呈负相关。该试剂盒具备灵敏度高、特异性强、重复性好、操作简便快速等优势，对血清中褪黑素（MT）含量的变化具备可靠的检出能力。 试剂盒限制 本试剂盒仅用于科研，严禁用于临床诊断。 请在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品切勿使用。 请勿与其他厂家的试剂盒或组分混用。 若样品需稀释，可使用 PBS（PH7.4）。 若样本值高于最高标准品浓度，需适当稀释后重新测定。 检测前需排除待测样本中可能存在的异嗜抗体对检测结果的干扰。 本试剂盒测定结果与通过其他方法得到的结果不具有直接可比性。 技术提示 混合蛋白溶液时，注意避免起泡。 加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分悬臂加样，防止交叉污染。 确保合适的温育时间和充分的洗涤步骤，以保证实验结果的准确性。 使用自动洗板机时，加入 30 秒浸泡步骤可提高检测精度。 底物溶液应为无色液体，若保存过程中变为蓝色，表明已失效，不可使用。 终止液加样顺序与底物溶液一致，加入后蓝色底物产物会瞬间变为黄色。 实验用剩的板条，应立即放回自封袋密封，低温干燥保存。 所有液体组分使用前需充分摇匀，严格按说明书的时间、加样量及顺序进行温育操作。 试剂盒组分与保存 未开封的试剂盒应保存在 2 - 8℃，过期试剂盒禁止使用。其组分包括： 校准品：0.5ml / 管 * 6 管，由抗原配制的 6 个浓度标准品，浓度依次为 80、40、20、10、5、0pg/mL。 包被微孔板：有 96T/48T 规格，预包被固相抗体。 SA - HRP：12mL，为 HRP 标记物。 Asaay Diluent：12mL，用于分离 MT 与结合蛋白。 TMB：12mL，TMB 工作液。 终止液：12mL，2mol/L 稀释液。 20× 浓缩洗涤液：30mL，含 0.15% Tween20 的 PBS。 说明书：1 份。 自封袋：1 个。 不干胶：2 片。 其他用品 实验需准备酶标仪（450nm）、精密移液器及一次性吸头、蒸馏水、洗瓶或者自动洗板机、37℃水浴锅或恒温箱、500ml 量筒。 生物安全 检测需符合实验室管理规范，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和废弃物都应按传染物处置。 试剂盒液体组分含 proclin - 300 防腐剂，可能引起皮肤过敏，避免吸入烟雾与皮肤接触。 底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激，避免吸入烟雾。 实验时应戴上防护手套，完成后彻底洗手。 样品的采集和储存 细胞培养上清：4000rpm 离心 20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存于 - 20℃以下，避免反复冻融。 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作避免细胞刺激，4000rpm 离心 20min 分离血清，保存于 - 20℃以下，避免反复冻融。 血浆：用肝素、EDTA 或柠檬酸钠抗凝，4000rpm 离心 20 分钟取上清，保存于 - 20℃以下，避免反复冻融。 组织：用预冷的 PBS (0.01 M,pH = 7.4) 冲洗组织，去残留血液，称重剪碎。按 1 : 9（可调整）体积比与 PBS（含蛋白酶抑制剂）在冰上研磨，可超声破碎或反复冻融，5000×g 离心 5 - 10 分钟取上清检测。 样本在 2 - 8℃可储存 72h，或在 - 20℃储存 6 个月。若样本收集后未一次检测完，需按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时室温解冻并确保均匀充分。 检验方法操作程序 将试剂移至室温平衡两小时，按当批检测数量，用蒸馏水 1：20 稀释浓缩洗涤液，混匀备用。 取出预包被板，设空白对照孔（不加液体），每个校准品设 2 孔，每孔加对应校准品 15μl，其余检测孔加待测血清或质控品 15μl。 除空白孔外，所有孔加 Asaay Diluent 100μl，混匀，贴封板膜，37℃温育 60 分钟。 洗板： 手工洗板：弃去孔内液体，注满洗涤液，静置 10 秒甩干，重复 3 次后拍干。 洗板机洗板：选择洗涤 3 次程序洗板后拍干。 每孔加 SA - HRP 100μl（空白对照孔除外），混匀，贴封板膜，37℃温育 30 分钟。 重复第 4 步洗板操作。 每孔加 TMB 100μl，振荡混匀，37℃避光显色 15 分钟，每孔加终止液 100μl。用酶标仪在 450nm 波长下，先以空白对照孔调零点，再测定各孔光密度值（OD 值）。 结果计算 检测完成后，以标准品浓度为纵坐标，对应的吸光度（OD 值）为横坐标，利用计算机软件采用四参数 Logistic 曲线拟合（4 - pl）创建标准曲线方程。通过样本的吸光度（OD 值），利用方程计算样品浓度值。若样品被稀释，测得的浓度值需乘以稀释倍数，即为样品最终浓度。 试剂盒性能指标 物理性能：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物，所有组分包装无破损，各组分装量不少于要求。 剂量反应曲线线性：用四参数 Logistic 曲线拟合（4 - pl），剂量 - 反应曲线相关系数（r）的绝对值不低于 0.9900。 精密度： 批内精密度：三组高、中、低浓度样品在同一板块内进行二十次精度评估，批内变异系数 CV% 小于 15%。 批间精密度：三组高、中、低浓度样品在不同板块内进行二十次精度评估，批间变异系数 CV% 小于 15%。 灵敏度：最低检出限不高于 0.1pg/mL。 回收率：三组高、中、低浓度样品在同一板块内进行五次回收率评估，回收率在 85% - 115% 之间。 稳定性：2℃ - 8℃保存，有效期 6 个月。 检测范围：5 pg/mL – 80 pg/mL 。 |
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