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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 一个长引物PCR的问题
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haidiguyue

铁虫 (初入文坛)

[交流] 一个长引物PCR的问题

原创！


也算是pcr老手了，设计过不下200条引物，一直使用oligo6软件，几乎没有用过其它软件，主要是习惯了！

当然高手不敢当，有点经验而已，说说我前几天的PCR扩增情况吧，希望对广大坛友有所帮助，我们共勉共励，

共同进步。

话说前几天，本人设计了一对引物，长度分别为21和24个碱基，退火温度57度，30’，目标片段700bp，用普通taq扩增的非常好，然而在5‘端加了酶切位点和保护碱基之后，长度分别为32至35之间，却怎么也扩不出来，延长退火时间至45‘，降低温度至50，53度，引物二聚体贼亮，改用温度梯度，50－65度，就是无有效扩增，怎么回事？

我坐下来想了想，不由哑然失笑，大脑年久失修了！
记得刚读研究生时，我设计了很多引物，纯粹为了学习，我喜欢地用温度梯度和退火时间梯度（退火时间梯度自己每次多跑几个单独PCR实验，PCR仪比较紧张，这样也是为了节省时间，呵呵！很多引物只需15妙甚至10秒的退火时间就可以了，长引物尤其有效。

想想clontech的Smart扩增技术吧，5秒就够了，于是将退火时间缩短至15妙，扩出来了，效果很好，55－65度的宽广范围啊！

然而新问题又来了，用了toyobo的kod－plus高保真酶又扩不出来了，遂将镁离子浓度提高两倍，扩出来了，效果不好，同时两个重复，各有一个没扩出来，再想想，延长延伸时间10秒，结果完美！

引物太长，就缩短退火时间，提高退火温度，杜绝形成引物二聚体，

用高保真酶时，由于扩增效率低，适当延长延伸时间是正确地选择！



下面的顶啊！


发帖挣钱娶媳妇了！

[ Last edited by amisking on 2009-10-30 at 11:54 ]
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1楼 2009-10-30 10:15:18
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fungi1205

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0): 11-9 17:42
引物太长，就缩短退火时间，提高退火温度，杜绝形成引物二聚体，

用高保真酶时，由于扩增效率低，适当延长延伸时间是正确地选择！

不错，很好的建议哦~
下次设计长引物后可以试试~谢谢楼主~
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加油，发挥人生最大的热量温暖身边的人
9楼2009-10-30 14:45:28
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普通回帖

fykxy_206

木虫 (正式写手)
★
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学习了 ，刚好设计了长引物  还没有p呢。
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2楼2009-10-30 10:24:54
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zywpp

木虫 (正式写手)
★
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长见识了
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平时.常思自己过，闲谈.莫论他人非。
3楼2009-10-30 10:40:53
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zier1011

木虫 (著名写手)
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amisking(金币+2,VIP+0): 10-30 11:55
我只能坐地板了
楼主的经验能让人豁然开朗的，虽然鄙人目前不做PCR，而且因为工作性质的问题，估计以后也不会做PCR，除非换了工作，可是我还是喜欢来看看，一来自己以前所学不至于全忘了，二来，说不定以后真的会换工作
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花还香香的
4楼2009-10-30 10:51:43
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雨后郁金香

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看了两遍，终于明白了楼主表达的意思，嘿嘿，不错，很适用偶。。。学习了。。。
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5楼2009-10-30 10:52:47
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qqsvery

木虫 (著名写手)
来学习哈！先回帖再看！
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谎言和真实在河边洗澡，谎言先洗好，穿走了真实的衣服，真实却不肯穿谎言的衣服。后来人们眼里只有穿着真实衣服的谎言，却很难接受赤裸裸的真实。
6楼2009-10-30 10:58:38
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qqsvery

木虫 (著名写手)
★ ★
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amisking(金币+1,VIP+0): 11-2 12:31
引物太长，就缩短退火时间，提高退火温度，杜绝形成引物二聚体，

用高保真酶时，由于扩增效率低，适当延长延伸时间是正确地选择！

很好，下次试试！
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谎言和真实在河边洗澡，谎言先洗好，穿走了真实的衣服，真实却不肯穿谎言的衣服。后来人们眼里只有穿着真实衣服的谎言，却很难接受赤裸裸的真实。
7楼2009-10-30 11:03:24
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feelalone

木虫 (小有名气)
★
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不错的建议啊。。谢谢谢谢。。
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8楼2009-10-30 11:06:19
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
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很好的经验，学习了，顶下。
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Thank-you，so-blue.
10楼2009-10-30 16:08:55
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