24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

masterHT

铁虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 72.1
帖子: 20
在线: 6.2小时
虫号: 22190512
注册: 2020-05-20
专业: 中药学其他科学问题

[交流] 常见重组蛋白中核酸残留去除问题已有1人参与

最近接手过几个项目都是要求将产品中核酸残留水平控制在一个极低水平。众所周知常见核酸在pH中性环境下带负电荷结合阴离子层析填料，常用强阴离子及肝素进行分离纯化。
   在此想讨论的是核酸被蛋白包裹在三维结构中时的核酸去除方法。由于核酸被包裹在蛋白中导致我们在核酸胶中无法观测到核酸残留，这时候可以在跑核酸胶前往样品中添加蛋白变性loading，通过SDS打开蛋白折叠结构释放核酸就可以通过核酸胶清晰看到核酸残留条带。
   刚开始接触到这个项目确实很头大，毕竟核酸与蛋白结合是一种物理镶嵌，基本上在各种填料上结合后洗脱时蛋白与核酸都是同梯度下被连带洗脱出来。后来是通过硫酸铵分级沉淀打开核酸与蛋白的镶嵌后采用核酸酶对核酸进行降解后回挂得到核酸残留极低的样品。但是该方法并不适合所有蛋白，最近接手的另外一个项目想通过同样方式可惜不行，核酸依旧被牢牢包裹在蛋白中，过夜用核酸酶处理蛋白依旧还有核酸残留。
   看别的论坛里面说罗氏的专利有些过使用1.5M氯化钠处理蛋白可以分离核酸与蛋白，我就试了1M，2M，3M梯度。确实在其中一个蛋白有点效果，在不添加蛋白变性loading情况下能看到些许释放出来的核酸条带，可能时间短了（室温4h）。但这个方法在我这个项目中并不太现实。我这个蛋白疏水性有点太弱了，70%硫酸铵饱和度下才能沉淀目的蛋白，所以相对来说比较稳定。可能是该原因导致无法想之前那个项目一样去除核酸。
   也想看有没有大牛有过这方面的项目经验，大家一起交流下心得